槲皮素預(yù)處理高糖環(huán)境培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)觀察

江穎娟，蔣作鋒，岑俊林，李桂東，余慧文

廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，廣州510220

糖尿病的發(fā)病率逐漸升高，糖尿病及其慢性并發(fā)癥可嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。大血管的動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致糖尿病患者致殘乃至病死的主要原因之一。氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)程可能發(fā)揮重要作用。由于氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致糖尿病患者組織中ROS過量產(chǎn)生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。持續(xù)的高血糖狀態(tài)還可觸發(fā)患者體內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活分子伴侶糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡程序［2］，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。最新研究［3］發(fā)現(xiàn)，高血糖狀態(tài)下人體內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可互相促進(jìn)，進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。深入研究靶向氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制可能為為糖尿病并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新思路。中藥具有穩(wěn)定性好、不良反應(yīng)輕、療效明確等優(yōu)點(diǎn)，中藥用于治療慢性病的基礎(chǔ)研究是目前的研究熱點(diǎn)之一。槲皮素是一種具有很多種生物學(xué)活性的天然黃酮類物質(zhì)，具有促進(jìn)氧自由基清除、抵抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用［4］。近期有研究［5］指出，槲皮素可抑制病毒感染導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激有關(guān)。有研究［6］指出，槲皮素可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。槲皮素是否通過抑制氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。自2020 年3 月起，我們觀察了不同劑量槲皮素預(yù)處理后采用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況，旨在為研究槲皮素治療糖尿病并發(fā)癥動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購買自上海艾研科技有限公司。槲皮素單體、DMEM 低糖培養(yǎng)基、CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒自Sigma 公司；PBS 粉、胰酶、胎牛血清等購自美國Hyclone 公司。蛋白提取試劑盒購自Bioworld 公司。抗C/EBP同源蛋白（CHOP）抗體、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12（Capsae12）抗體、GRP78抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自Zenbio 公司。LDH 檢測(cè)試劑盒、ROS 檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物。凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC/PI 購自南京凱基生物公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、各種離心管和不同型號(hào)的細(xì)胞培養(yǎng)板等購自美國Corning公司［7］。

1.2 內(nèi)皮細(xì)胞分組及槲皮素處理方法 在37 ℃、含CO2為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中采用培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后按照分組情況處理細(xì)胞。將內(nèi)皮細(xì)胞分為槲皮素組（Q20 組、Q50 組、Q100 組）、高糖組（HG 組）及正常對(duì)照組（Control組），Q20組預(yù)先加入20 μmol/L的槲皮素預(yù)處理1 h，再加入10 mg/L的葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞，Q50組預(yù)先加入50 μmol/L 的槲皮素預(yù)處理1 h，再加入10 mg/L 的葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞，Q100 組預(yù)先加入100 μmol/L 的槲皮素預(yù)處理1 h，再加入10 mg/L 的葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞。HG 組在培養(yǎng)液中加入10 mg/L的HG 培養(yǎng)細(xì)胞，Control 組采用低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 各組內(nèi)皮細(xì)胞活性觀察

1.3.1 各組細(xì)胞活性測(cè)算 取各組細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度5×107/L。培養(yǎng)24 h時(shí)按照說明書向每孔細(xì)胞加入CCK-8 溶液，在37 ℃下培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組光密度（450 nm波長）OD 值，并計(jì)算各組細(xì)胞活性。細(xì)胞活性（%）=［藥物組OD 值－空白對(duì)照孔OD 值］÷［正常組OD值－空白對(duì)照孔OD值］×100%。各組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。培養(yǎng)24 h 時(shí)收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，按照說明重懸細(xì)胞于Binding Buffer 中，分別向每管細(xì)胞內(nèi)加入10 μL Annexin V和10 μL PI試劑，室溫避光放置10 min，加入Binding Buffer，流式細(xì)胞儀測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激情況觀察

1.4.1 各組細(xì)胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長期各組細(xì)胞接種于6孔板，貼壁生長培養(yǎng)至80%左右，每孔分別加入終濃度為20 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，PBS 洗滌內(nèi)皮細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，最含3%FBS 的PBS 懸浮細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞ROS。用平均熒光強(qiáng)度（median fluorescent intensity，MFI）代表ROS 含量。各組重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性檢測(cè) 培養(yǎng)24 h 時(shí)取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min 離心10 min，采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性。各組重復(fù)不少于3次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況觀察 采用Western Blotting 法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞GRP78、CHOP 和Caspase12。培養(yǎng)24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒說明書提取核蛋白，測(cè)定蛋白濃度并調(diào)整蛋白至合適濃度，取30 μg 蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 分離，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，采用脫脂牛奶持續(xù)封閉4 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗繼續(xù)室溫孵育1 h，TBST 清洗后用Odyssey 凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，所得結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參［7］。各組重復(fù)3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理。采用Kolmogorov-Smirnov test 檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布，成正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析One-way ANOVA。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組內(nèi)皮細(xì)胞活性比較 培養(yǎng)24 h 時(shí)Control組、Q20 組、Q50 組、Q100 組、HG 組及內(nèi)皮細(xì)胞活性分別為100%、88.50% ± 4.01%、90.93% ± 2.83%、92.525±2.46%、80.56%±3.36%、，與Control 組比較，HG 組內(nèi)皮細(xì)胞活性下降（P＜0.01）；與HG 組比較，Q20組、Q50組、Q100組內(nèi)皮細(xì)胞活性增加，且隨濃度增加，細(xì)胞活性上升（P均＜0.01）。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)24 h 時(shí)Q20 組、Q50 組、Q100 組、HG 組及Control 組細(xì)胞凋亡率分別為19.20% ± 1.78%、14.56% ± 1.47%、9.00% ±3.12%、23.46% ±1.80%、3.47% ±0.96%。與Control 組比較，HG 組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）；與HG組比較，Q20 組、Q50 組及Q100 組細(xì)胞凋亡率降低，且隨槲皮素濃度增加，細(xì)胞凋亡率下降（P均＜0.01）。

2.3 各組細(xì)胞ROS 含量比較 培養(yǎng)24 h 時(shí)Q20組、Q50 組、Q100 組、HG 組及Control 組細(xì)胞ROS 含量分別為215.67 ± 4.51、185.33 ± 17.79、144.00 ±9.17、233.67 ± 8.50、119.66 ± 5.86。與Control 組比較，HG 組細(xì)胞ROS 含量升高（P＜0.05）；與HG 組比較，Q20 組、Q50 組及Q100 組細(xì)胞ROS 含量降低，且隨槲皮素濃度增加，ROS含量降低（P均＜0.01）。

2.4 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性比較 培養(yǎng)24 h時(shí)Q20 組、Q50 組、Q100 組、HG 組及Control 組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性分別為（152.33 ± 11.02）、（129.00 ± 13.00）、（116.67 ± 19.01）、（160.00 ±13.11）、（98.67±7.02）U/L。與Control 組比較，HG組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性升高（P＜0.05）；與HG 組比較，Q50組及Q100組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性降低（P均＜0.05）；與Q50 組比較，Q100 組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性降低（P均＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞GRP78、CHOP 和Caspase12 表達(dá)量比較 培養(yǎng)24 h 時(shí)各組細(xì)胞GRP78、CHOP 和Caspase12表達(dá)量比較見表1。

表1 培養(yǎng)24 h時(shí)各組細(xì)胞GRP78、CHOP和Caspase12表達(dá)量比較（）

表1 培養(yǎng)24 h時(shí)各組細(xì)胞GRP78、CHOP和Caspase12表達(dá)量比較（）

注：與Control組比較，＊P＜0.05；與HG 組比較，＃P＜0.05；與Q20組比較，＆P＜0.05；與Q50組比較，ΔP＜0.05。

3 討論

長期的高血糖狀態(tài)是導(dǎo)致糖尿病患者并發(fā)心腦血管疾病的主要原因。血糖水平的高低與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度呈正相關(guān)，也是亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化的指標(biāo)之一［8］。同時(shí)還有研究表明，高血糖可促進(jìn)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附，誘發(fā)出一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。因此應(yīng)該及早干預(yù)并嚴(yán)格控制糖尿病患者的血糖水平，減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

槲皮素屬于黃酮類化合物的一種，分布廣泛，存在于洋蔥、漿果、甘藍(lán)、蘋果以及茶和紅酒中，以往的研究表明槲皮素具有一定的抗炎、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等作用［9］，但其對(duì)高糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用目前研究較少。本研究中結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性較Control 組明顯下降，同時(shí)細(xì)胞膜損傷程度和細(xì)胞凋亡較Control 組明顯升高，說明高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的損傷作用，這一結(jié)果與其他課題組的研究結(jié)果具有一致性［10］；同時(shí)本研究證實(shí)槲皮素可改善高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性、細(xì)胞膜損傷，減少細(xì)胞凋亡，初步表明槲皮素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，但其是否與氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)仍需要進(jìn)一步研究。

目前長期的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的的ROS 與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不平衡，過量生成的ROS引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，增加了內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［11］。研究［12］報(bào)道，槲皮素通過減少角膜上皮細(xì)胞ROS 的生成發(fā)揮保護(hù)角膜保護(hù)作用。還有研究［13］指出槲皮素通過拮抗氧化酶的作用抑制H2O2誘導(dǎo)的嗜鉻細(xì)氧化損傷。以上這些研究表明槲皮素可通過對(duì)氧化的抑制發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，但槲皮素對(duì)高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激的研究較少，本研究采用高糖條件下的內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，高糖明顯促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞ROS 的表達(dá)，這與以往的研究結(jié)果是一致的［14］，同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素可明顯減少高糖培養(yǎng)條件下內(nèi)皮細(xì)胞ROS 的生成，這一結(jié)果初步表明槲皮素可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)改善高糖培養(yǎng)條件下內(nèi)皮細(xì)胞的活性，減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，當(dāng)然這一過程還有可能有其他機(jī)制的參與。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)錄后修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞器，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有非常重要作用，各種生理和病理因素都可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的積累，即形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了人類很多常見疾病的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白，分別是肌醇需求因子1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、類蛋白激酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK），它們負(fù)責(zé)激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的三條信號(hào)通路［15］。正常情況下三者與分子伴侶GRP78 相結(jié)合，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78與IRE1、ATF6 以及PERK 分離，并進(jìn)一步激活下游的相關(guān)凋亡信號(hào)［16］。近年來大量研究［17-18］表明，糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，持續(xù)高血糖狀態(tài)可通過誘導(dǎo)炎癥因子及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［19］。糖尿病、肥胖和代謝綜合征患者的GRP78、CHOP 以及凋亡信號(hào)分子Caspase12 等的水平可能是提示動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的重要標(biāo)志［20］。糖尿病持續(xù)的高血糖狀態(tài)誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互促進(jìn)，進(jìn)一步促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。槲皮素可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK、IPE1、CHOP 的表達(dá)以及JNK 的磷酸化減少不對(duì)稱二甲基精氨酸處理下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［21］；槲皮素還可通過抑制GRP78、CHOP的表達(dá)抑制多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，減少細(xì)胞凋亡［22］。因此槲皮素在一定的條件下可以抑制某些細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，但槲皮素是否抑制高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，目前報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)高糖可以引起內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP 以及Caspase12 的表達(dá)增加，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，而槲皮素則可明顯減少高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞GRP78、CHOP 以及caspase12 蛋白的表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，這些結(jié)果提示槲皮素可能通過抑制高糖引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，槲皮素預(yù)處理可能提高槲皮素能增強(qiáng)高糖培養(yǎng)液中的內(nèi)皮細(xì)胞活力，降低細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性，抑制細(xì)胞凋亡，降低ROS 含量，抑制細(xì)胞GRP78、CHOP 及Caspase 12 表達(dá)，且呈一定劑量依賴性。槲皮素在高糖條件下可能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。槲皮素對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞有一定程度的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制高糖引發(fā)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。