妊娠期高血壓患者子代胎盤組織中長(zhǎng)非編碼RNA表達(dá)差異分析

高永寧，劉珍珍，李玉明，胡金朋

妊娠期高血壓是妊娠婦女妊娠20周后新出現(xiàn)的血壓異常升高[收縮壓和(或)舒張壓≥140/90 mmHg]，血壓在分娩后可恢復(fù)正常[1]。妊娠期高血壓發(fā)病率為2%～8%，可造成胎兒窘迫、早產(chǎn)、胎兒發(fā)育遲緩、胎盤早剝、新生兒死亡等不良妊娠結(jié)局。臨床主要采取對(duì)癥治療，如擴(kuò)容、降壓、解痙等，而終止妊娠或分娩是唯一的根治方法。目前關(guān)于妊娠期高血壓具體的發(fā)病機(jī)制或分子途徑仍不十分清楚，但研究顯示，妊娠期高血壓患者胎盤常伴有動(dòng)脈硬化和梗死，而這與滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)及螺旋動(dòng)脈的生理性改變具有相關(guān)性，最終導(dǎo)致胎盤缺血，因此認(rèn)為滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲功能障礙可誘發(fā)妊娠期高血壓[2]。長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)作為一種調(diào)控因子，在分子水平參與了核質(zhì)運(yùn)輸、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體劑量補(bǔ)償及mRNA剪接、翻譯等[3]；而在細(xì)胞水平，lncRNA則參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等的調(diào)節(jié)，因此lncRNA與機(jī)體發(fā)育過(guò)程和多種疾病有關(guān)，但具體作用機(jī)制還不十分清楚[4-5]。近年來(lái)，lncRNA在妊娠期高血壓中的表達(dá)情況及可能發(fā)病機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)，研究顯示，妊娠期高血壓患者胎盤內(nèi)lncRNA的差異表達(dá)與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞功能相關(guān)[6]。因此，本研究擬通過(guò)采用高通量測(cè)序手段分析妊娠期高血壓患者和健康孕婦分娩后的胎盤組織，探討妊娠期高血壓患者lncRNA表達(dá)情況及相關(guān)靶基因富集通路，有望為尋找妊娠期高血壓患者早期生物學(xué)標(biāo)志物及其可能發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1組織樣本收集 選取在武警特色醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科于2018年1—6月收治的健康產(chǎn)婦及妊娠期高血壓產(chǎn)婦各15例分別作為健康對(duì)照組(C組)及妊娠期高血壓組(M組)。從每組15例產(chǎn)婦中各選取9例產(chǎn)婦胎盤組織用于高通量測(cè)序檢測(cè)，余6例產(chǎn)婦胎盤組織用于后期高通量測(cè)序檢測(cè)lncRNA差異表達(dá)的臨床驗(yàn)證。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1妊娠期高血壓組：納入標(biāo)準(zhǔn)：①30～35歲且為單胎妊娠的孕產(chǎn)婦；②隨機(jī)尿蛋白+以上或24 h尿蛋白>0.3 g；③妊娠20周后新診斷的高血壓，即舒張壓≥90 mmHg和(或)收縮壓≥140 mmHg；④無(wú)尿蛋白情況下，新發(fā)的高血壓伴血小板減少癥、腎功能不全、肝功能損害、肺水腫、神經(jīng)系統(tǒng)異常或視覺異常任一情況。

1.2.2對(duì)照組：納入標(biāo)準(zhǔn)：①30～35歲且為單胎妊娠的孕產(chǎn)婦；②孕期血壓正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非自然受孕；②多胎妊娠或者胎兒發(fā)育畸形；③胎盤位置或形態(tài)異常；④羊水過(guò)多或胎膜早破；⑤產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi)血壓仍未恢復(fù)正常；⑥合并其他疾病。

1.3樣本處理及RNA提取 胎兒娩出5 min內(nèi)，在臍帶附著點(diǎn)母體面同一部位取胎盤組織，去除血管及蛻膜胎膜，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗新鮮標(biāo)本后，保存在液氮中備用。從每個(gè)胎盤組織中取0.2 cm3大小組織，加入Trizon 5 ml后加入氯仿0.3 ml，組織破碎儀(2000 r/min)破碎組織，冰盒上放置5 min。12 000 r/min離心15 min(4 ℃)，把水相層移至新的RNase-Free離心管中，加入等體積70%乙醇，混勻；加入吸附柱RM中，12 000 r/min離心30 s(4 ℃)，棄流出液；加入RW1洗滌沉淀，12 000 r/min離心30 s(4 ℃)，棄流出液，共3次；把吸附柱裝入新離心管中，加入無(wú)RNase水(35 μl)，溶解RNA，12 000 r/min離心1 min(4 ℃)；流出液加入吸附柱內(nèi)，12 000 r/min離心1 min(4 ℃)，最終得到RNA保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.4高通量測(cè)序檢測(cè)lncRNA表達(dá)水平 測(cè)序前先將每組9例樣本再次隨機(jī)分為3組，每組3例，將各組內(nèi)的3個(gè)樣本等量混合后加入至離心管內(nèi)，構(gòu)成新的樣本M1、M2、M3與C1、C2、C3。先通過(guò)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)評(píng)估與質(zhì)控，再通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)颖緈RNA的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)lncRNA表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，將相關(guān)性絕對(duì)值>0.95的mRNA作為lncRNA預(yù)測(cè)靶基因；對(duì)比分析lncRNA antisense表達(dá)水平。利用RNAplex軟件通過(guò)2個(gè)長(zhǎng)鏈RNA間相互作用來(lái)預(yù)測(cè)mRNA與反義lncRNA間的結(jié)合互補(bǔ)，通過(guò)所有基因(轉(zhuǎn)錄本)的小提琴圖及表達(dá)量分布圖比較各組表達(dá)水平，最后取平均值。而對(duì)于無(wú)生物學(xué)重復(fù)的樣本，先將read count數(shù)據(jù)通過(guò)TMM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后通過(guò)DEGseq進(jìn)行差異分析；而對(duì)于有生物學(xué)重復(fù)的樣本，通過(guò)DESeq2分析。為了得到差異顯著的基因，將篩選條件設(shè)為：差異倍數(shù)|Fold Change|>2且Q值<0.05。篩選有差異的lncRNA后，研究其靶基因?qū)?yīng)基因在注釋功能中的分布情況，以闡明樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。使用String在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://stringdb.org/)導(dǎo)入篩選的差異基因，得到其所編碼的蛋白質(zhì)間相互作用，之后行聚類分析，找出網(wǎng)絡(luò)核心關(guān)鍵蛋白，分析差異lncRNA對(duì)應(yīng)靶基因的相互作用。

1.5進(jìn)一步驗(yàn)證2組子代胎盤中l(wèi)ncRNA差異表達(dá) 根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因序列并合成引物。測(cè)定2組剩余6例子代胎盤高通量測(cè)序檢測(cè)結(jié)果顯示lncRNA差異表達(dá)最顯著的RNA純度、濃度，取1.5 μl RNA原液測(cè)定在280、260 nm處的光密度值。RNA純度=吸光度260/吸光度280，RNA濃度=吸光度260×4(ng/μl)。最后，RNA逆轉(zhuǎn)錄后行熒光定量PCR。

2 結(jié)果

2.1樣本測(cè)序原始序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) C1～3組分別讀取53325958、58331146、52276474條序列，M1～3組共讀取50851088、49712562、59418802條序列，其中堿基質(zhì)量>20的數(shù)目比例均>98.40%，堿基質(zhì)量>30的數(shù)目比例均>94.50%。見表1。

表1 樣本測(cè)序原始序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2數(shù)據(jù)結(jié)果比對(duì) 各個(gè)樣本所測(cè)得序列可定位到基因組上的均有97%以上，可比對(duì)到外顯子上的整段測(cè)序序列有78%以上。見表2及表3。

表2 健康產(chǎn)婦測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果

表3 妊娠期高血壓產(chǎn)婦測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果

2.3lncRNA篩選 分別將測(cè)序所得lncRNA序列導(dǎo)入4種編碼潛能分析軟件(PLEK、Pfam、CPC2、CNCI)進(jìn)行功能篩選(表4)，最終均出現(xiàn)在上述4種軟件中具有編碼潛能的lncRNA共有884個(gè)(圖1)，將其作為lncRNA數(shù)據(jù)集，主要包括131個(gè)lncRNA、257個(gè)sense_intronic lncRNA、73個(gè)antisense lncRNA、423個(gè)sense_overlapping lncRNA，見圖2。lncRNA在染色體上的分布：以1～4、6號(hào)染色體為主，性染色體中以X染色體為主。見圖3。lncRNA特征結(jié)果分析顯示：lncRNA序列中外顯子數(shù)目少于mRNA，而內(nèi)含子數(shù)量則與mRNA相似，而開放閱讀框長(zhǎng)度則更短。見圖4。

表4 長(zhǎng)非編碼RNA篩選統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖1 長(zhǎng)非編碼RNA編碼潛能分析預(yù)測(cè)維恩圖

圖2 長(zhǎng)非編碼RNA分類

圖3 長(zhǎng)非編碼RNA在染色體上的分布

圖4 長(zhǎng)非編碼RNA特征比較

2.4lncRNA差異表達(dá)結(jié)果 2組樣本內(nèi)差異表達(dá)lncRNA共有32個(gè)(19個(gè)下調(diào)、13個(gè)上調(diào))，其中6個(gè)lncRNA(ENST00000492363、ENST00000555581、ENST00000494550、ENST00000531484、ENST00000485594、ENST00000489582)差異倍數(shù)>15。見表5。差異表達(dá)lncRNA聚類分析見圖5。

圖5 差異表達(dá)長(zhǎng)非編碼RNA聚類分析

表5 長(zhǎng)非編碼RNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5差異表達(dá)lncRNA對(duì)應(yīng)靶基因的GO富集分析 GO富集分析顯示，主要富集的生物學(xué)過(guò)程為多細(xì)胞生物過(guò)程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、生物過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)、生物調(diào)節(jié)、發(fā)展過(guò)程、代謝過(guò)程。主要富集的細(xì)胞組分為膜腔、細(xì)胞器部分、胞外區(qū)、單元格部分、胞外區(qū)部分、細(xì)胞器、細(xì)胞外基質(zhì)；主要富集的分子功能為轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)合、催化活性，信號(hào)傳感器活動(dòng)、蛋白質(zhì)結(jié)合、形態(tài)發(fā)生活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、電子轉(zhuǎn)移活性。見圖6。

圖6 差異表達(dá)長(zhǎng)非編碼RNA對(duì)應(yīng)靶基因GO富集分析

2.6差異表達(dá)lncRNA對(duì)應(yīng)靶基因的KEGG通路富集分析 富集基因數(shù)>40個(gè)的通路共有41條，包括12條代謝相關(guān)通路、10條有機(jī)體系統(tǒng)相關(guān)通路、8條人類疾病相關(guān)通路、4條細(xì)胞過(guò)程相關(guān)通路、4條遺傳信息通路、3條環(huán)境信息相關(guān)通路。見圖7。

圖7 差異表達(dá)長(zhǎng)非編碼RNA對(duì)應(yīng)靶基因KEGG通路富集分析

2.7差異表達(dá)lncRNA對(duì)應(yīng)靶基因的相互作用分析 處于網(wǎng)絡(luò)中核心位置的差異表達(dá)lncRNA對(duì)應(yīng)靶基因主要包括 PSMB10、RELA、CASP10、RPS27A、EIF4G1、GNB2L1、PSMF1、DDX6等基因。見圖8。

圖8 差異表達(dá)長(zhǎng)非編碼RNA對(duì)應(yīng)靶基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.82組子代胎盤組織ENST00000492363表達(dá)水平 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)Gen Bank獲得基因序列(表6)。2組子代胎盤組織ENST00000492363表達(dá)水平比較顯示，妊娠期高血壓產(chǎn)婦子代胎盤組織中ENST00000492363表達(dá)水平為(1.45±0.12)顯著高于正常妊娠孕婦胎盤組織的(1.04±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表6 妊娠期高血壓產(chǎn)婦和正常妊娠產(chǎn)婦基因序列

3 討論

妊娠期高血壓可長(zhǎng)期影響后代及母親的健康。妊娠期高血壓的主要特點(diǎn)是滋養(yǎng)層細(xì)胞侵及子宮，引發(fā)胎盤灌注不足，但其有效治療靶點(diǎn)目前仍不清楚。近年來(lái)基因組測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，研究顯示人類基因組內(nèi)僅有1%～2%的基因可翻譯為蛋白質(zhì)，但大量其他不能翻譯為蛋白質(zhì)的基因在不同的生物學(xué)過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，如lncRNA[7]。

lncRNA作用機(jī)制非常復(fù)雜，雖然其在眾多疾病生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是至今仍有諸多問(wèn)題尚未闡明[8]。研究顯示，lncRNA主要通過(guò)以下途徑發(fā)揮作用：①作為小分子RNA的前體，修飾成小分子RNA(如miRNA、piRNA)而發(fā)揮作用；②在編碼基因上游的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄，從而干擾基因的表達(dá)；③與編碼基因轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)的雙鏈，以干擾mRNA剪切；④結(jié)合特定的蛋白質(zhì)，從而調(diào)節(jié)其靶蛋白的活性，或改變蛋白質(zhì)的定位；⑤抑制組蛋白修飾、RNA聚合酶Ⅱ或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)；⑥組成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體，從而參與生物學(xué)過(guò)程[9]。

本研究結(jié)果顯示，M組胎盤組織中共有32種lncRNA與C組存在差異表達(dá)，表明妊娠期高血壓的發(fā)生、發(fā)展與lncRNA具有相關(guān)性。有研究顯示，與正常孕婦胎盤組織相比，子癇前期孕婦胎盤組織中LncRNA-HEIPP、lncRNA-TCL6的表達(dá)均顯著升高，而lncRNA-HEIPP下調(diào)促進(jìn)了滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲，其中低水平lncRNA-TCL6表達(dá)的子癇前期孕婦收縮壓和舒張壓、尿蛋白水平均明顯低于高lncRNA-TCL6表達(dá)的孕婦，且TCL6下調(diào)可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖，表明lncRNA-TCL6過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖，促進(jìn)高血壓的發(fā)生[10]。

本研究GO富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果表明，妊娠期高血壓的發(fā)生與胎盤的代謝改變具有相關(guān)性。有研究也表明，能量供應(yīng)不足可引起淺螺旋動(dòng)脈重構(gòu)及著床異常，從而會(huì)引起胎盤及胎兒代謝組學(xué)的變化，因此代謝異常可能是妊娠期高血壓的發(fā)病因素之一。妊娠過(guò)程中，葡萄糖是一種能量底物，也可調(diào)節(jié)胚胎著床及胎盤發(fā)育[11]。此外，游離脂肪酸代謝也為胎盤及胎兒發(fā)育提供了能量[12]。

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，基因CASP10、DDX6、PSMB10、EIF4G1、PSMF1、RELA、RPS27A、GNB2L1等處于網(wǎng)絡(luò)核心位置，表明在妊娠期高血壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程中上述基因發(fā)揮著重要作用。RPS27A位于細(xì)胞質(zhì)中，屬于核糖體蛋白S27AE家族成員，含C4型鋅指結(jié)構(gòu)域[13]。RELA則屬于NF-κB亞基，而NF-κB由RELA、NFKB1、NFKB2、NFKB1、Rel組成，NF-κB內(nèi)的RELA-REL、RELA-NFKB1可作為轉(zhuǎn)錄激活因子而發(fā)揮作用，如參與DNA結(jié)合、調(diào)節(jié)基因表達(dá)[14]；而NF-κB中RELA-RELA復(fù)合物則可通過(guò)侵襲素介導(dǎo)而參與IL-8表達(dá)活化[15]。PSMF1在調(diào)控蛋白酶體功能中具有重要作用，可抑制20S蛋白酶體水解肽底物及蛋白質(zhì)，也可抑制調(diào)節(jié)蛋白PA28、PA700激活蛋白酶體[16]。PSMF1通過(guò)11S和19S調(diào)節(jié)器抑制蛋白酶體的激活，也可通過(guò)與免疫蛋白酶體中的催化亞基2競(jìng)爭(zhēng)發(fā)揮作用[17]。GNB2L1參與多種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)[18]，可參與組成40S核糖體亞單位，當(dāng)核糖體在翻譯中停滯后，可通過(guò)活化穩(wěn)定蛋白激酶C，促進(jìn)PKC磷酸化，從而延長(zhǎng)G0/G1期，最終抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。CASP10為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族成員[20]，可參與細(xì)胞壞死、凋亡及炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)[21]。EIF4G1基因編碼蛋白組成蛋白復(fù)合體EIF4F，可促進(jìn)mRNA向核糖體的募集。DDX6屬于DEAD盒蛋白家族成員，具有mRNA降解及翻譯抑制功能，還可通過(guò)抑制ATG基因表達(dá)，從而阻斷自噬[22-23]。

總之，與健康產(chǎn)婦胎盤組織比較，妊娠期高血壓產(chǎn)婦胎盤組織中有ENST00000492363、ENST00000494550、ENST00000555581、ENST00000531484、ENST00000489582和ENST00000485594等32種lncRNA表達(dá)存在差異，其中ENST00000492363表達(dá)上調(diào)且差異倍數(shù)最大，臨床樣本定量分析也進(jìn)一步證實(shí)ENST00000492363表達(dá)存在差異性。另外，lncRNA靶基因富集于與物質(zhì)代謝具有相關(guān)性的通路，且PSMF1、DDX6、RPS27A、PSMB10、CASP10、GNB2L1、RELA、EIF4G1等基因處于網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中心，表明物質(zhì)代謝及上述基因可能與妊娠期高血壓發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，為妊娠期高血壓的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的方向。