Poloxamer188-聚L-乳酸質(zhì)量比100%～200%復(fù)合電紡纖維對所載多西紫杉醇釋放行為的影響

王瑛穎，董欣，黃佳娜，張?zhí)?，王?/p>

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.齊都藥業(yè)，山東 淄博 255400)

電紡纖維作為藥物釋放載體顯現(xiàn)出很多優(yōu)勢，如制備簡單、載藥量高、理化穩(wěn)定性好、釋放行為可調(diào)控性佳等。尤其是近些年采用電紡纖維對于水不溶藥物的包裹和緩釋引起了很多人的注意，因為其具有較明顯的藥劑學(xué)意義和實用價值[1-3]。在以高分子為基質(zhì)的藥物釋放載體中，若要使藥物呈現(xiàn)緩釋，均要求體系中含有水不溶的親脂片段，發(fā)揮與藥物結(jié)合或阻滯藥物擴散的功能。對于水不溶藥物，其必然結(jié)合在基質(zhì)的親脂部位，如膠束的親脂核心、囊泡的親脂層、水凝膠的親脂位點、微球的親脂基質(zhì)中等等[4-7]。但是這時會有一個關(guān)鍵問題出現(xiàn)，水不溶藥物在高分子基質(zhì)中的疏水部位移動并進一步擴散、釋放，能否進行？又靠什么機理和動力進行？現(xiàn)有的文獻報道提示，除膠束和囊泡能夠結(jié)合水不溶藥物并在體內(nèi)進行傳遞外，其他體系中的水不溶藥物均不能夠以被增溶的狀態(tài)釋放[8]。以水不溶藥物紫杉醇的電紡纖維為例，其所謂釋放是水不溶藥物隨著高分子材料的溶解、溶蝕從載體上剝離，故在測定藥物釋放量的方法上其并不是測定水性釋放介質(zhì)中溶解或被增溶藥物的量，而是通過有機溶劑萃取纖維中剩余的藥物或萃取釋放介質(zhì)中從纖維上剝離出的含藥水不溶固體顆粒中藥物的量[9-11]，水不溶藥物從水不溶纖維中以溶解或被增溶狀態(tài)釋放在相當(dāng)長的時期都沒有被實現(xiàn)。

近些年，人們探索構(gòu)建水不溶高分子材料與水溶性表面活性劑復(fù)合的藥物釋放載體，試通過高分子基質(zhì)的阻滯機理控制藥物的移動、擴散和釋放，同時通過表面活性劑增溶水不溶藥物使其在高分子基質(zhì)中水化、擴散，并進一步釋放。這其中，基于共溶液靜電紡絲制備所得表面活性劑復(fù)合脂肪族聚酯纖維對水不溶藥物的包裹和緩釋這一研究方向取得了明顯進展。一些水不溶藥物如來曲唑、阿那曲唑、己烯雌酚等被載入Poloxamer188復(fù)合的聚L-乳酸電紡纖維中，并且以被Poloxamer188增溶的方式釋放，結(jié)構(gòu)不同的三個藥物其釋放行為也大為不同[11-13]307-316。此外，還有研究將多西紫杉醇載入該體系，但是發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Poloxamer188與聚L-乳酸的質(zhì)量比小于1∶1復(fù)合且多西紫杉醇的載量較高時，其釋放狀態(tài)較為復(fù)雜。例如，當(dāng)多西紫杉醇載量為5%時，在突釋點，多西紫杉醇為結(jié)晶狀態(tài)，隨后為被增溶狀態(tài)；當(dāng)多西紫杉醇載量為20%時，在整個釋放過程，多西紫杉醇均為結(jié)晶狀態(tài)。同時，多西紫杉醇的載量對其本身的百分釋放量亦有明顯影響[10，14-15]227-231。

為了繼續(xù)探討Poloxamer188對聚L-乳酸電紡纖維中多西紫杉醇釋放狀態(tài)和釋放量的影響，本文將該表面活性劑的載量提高至為聚L-乳酸質(zhì)量的100%～200%。從實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了一些新現(xiàn)象，為進一步研究該體系對多西紫杉醇釋放行為的影響提供了參考和思路。

1 材料與儀器

多西紫杉醇(>99.0%，大連美侖生物技術(shù)，批號：S0901A)，Poloxamer188?(>99.0%，德國Basf?)；聚L-乳酸(n-十二醇引發(fā)L-丙交酯合成，質(zhì)均分子量15萬)；二氯甲烷(分析純，天津康科德科技有限公司)；乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司)；去離子水(德國Merck Millipore純水機)。

靜電發(fā)生器(天津東文靜電發(fā)生器廠)；掃描電子顯微鏡(日本Hitachi)，高效液相色譜-紫外分光光度儀(日本Shimadzu，ELITE LaChrom，L-2400型紫外檢測器、L-2130型泵)；恒溫空氣浴搖床 (THZ-82A型，浙江金壇天竟實驗儀器廠)。

2 方 法

2.1 多西紫杉醇電紡纖維的制備與形態(tài)

將設(shè)計量的多西紫杉醇、Poloxamer188和聚L-乳酸共同溶解在二氯甲烷中，磁力攪拌48 h得無色、透明、均一的紡絲溶液。為考察不同載量的多西紫杉醇和不同復(fù)合量的Poloxamer188對藥物釋放的影響，制備了2.5%、5%、10%(相對于聚L-乳酸質(zhì)量百分比)等3種不同載藥量和110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%(相對于聚L-乳酸質(zhì)量百分比)等3個系列20種載藥纖維。紡絲液體積固定為8 mL。多西紫杉醇、Poloxamer188、聚L-乳酸的用量及對應(yīng)產(chǎn)品命名，見表1。

表1 產(chǎn)品命名和對應(yīng)應(yīng)紡絲液中多西紫杉醇、Poloxamer188、聚L-乳酸的添加量，以及纖維直徑

參考預(yù)實驗結(jié)果和已有文獻，紡絲條件如下：紡絲電壓為15 000 V，供液速度為(2.5±0.2)mL/h，針頭噴絲口與錫箔平面之間的距離即紡絲距離為30 cm，空氣溫度為(25±5)℃，空氣相對濕度為65%。加電壓后，發(fā)現(xiàn)在針頭處形成了Taylor錐并拉成纖維，以高速不規(guī)則的螺旋軌跡運行至接收屏上。紡絲完畢后，接收屏上形成了一張由纖維層積而成的、約0.5 mm厚的氈。揭下后，(40±2)℃下真空抽干24 h，按一定規(guī)格用剪成小片后進行表征、藥物釋放研究[14-15]103-112,1-7。

將纖維膜剪切成5 mm×5 mm小片后用導(dǎo)電膠固定在金屬臺上并用金真空蒸鍍后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

剪下5 cm×5 cm纖維膜固定在鏤空的金屬片上并置于廣角X-射線衍射儀。室溫下測試，掃描范圍：5°～80°，掃描速率：5°/min。

2.2 藥物釋放

采用高效液相色譜法測定釋放介質(zhì)中多西紫杉醇的含量。色譜條件：色譜柱Elite?C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(v/v=50/50)；檢測波長為230 nm；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL[16]。

將樣品剪切成約5 cm×5 cm正方形條，使得每片的質(zhì)量約為50 mg，浸入10 mL純水釋放介質(zhì)中。置于恒溫空氣浴搖床中在37 ℃，100 r/min條件下振搖釋放。在設(shè)定的時間點取出全部釋放介質(zhì)進行多西紫杉醇含量的測定。之后在釋放介質(zhì)中重新添加10 mL新的釋放介質(zhì)。繪制絕對釋放量和相對釋放百分率對時間t的曲線，并采用Lagergren方程式相似形對所得曲線進行擬合，以研究其釋放機理。該式為：

Qt/Qreleased= ktn，兩邊取常用對數(shù)可得其變換式

lgQt/Qreleased= nlgt+lgk，

其中，Qt- t時刻藥物的百分釋放率；

Qreleased-平臺期藥物釋放百分率；

t-釋放時間；

k-釋放速率常數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 纖維形態(tài)與載藥

所得產(chǎn)品全部為無珠子的、直徑較為均一的纖維。其掃描電子顯微鏡下的低放大倍數(shù)形態(tài)如圖1所示?？梢园l(fā)現(xiàn)纖維表面光滑且無結(jié)晶狀態(tài)物質(zhì)析出。采用圖形軟件對纖維直徑進行測量所得結(jié)果見表1，纖維直徑均在5 μm以下。

3.2 藥物釋放

釋放實驗持續(xù)進行了672 h，即28 d。在本實驗中主要從兩方面考察多西紫杉醇釋放行為：(1)多西紫杉醇釋放量隨時間的變化即經(jīng)時釋放曲線；(2)多西紫杉醇以何種狀態(tài)釋放出纖維，是被增溶的狀態(tài)還是以結(jié)晶的狀態(tài)剝離纖維。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被考察的4組共20種纖維均分別具有各自的釋放規(guī)律，實驗結(jié)果見圖2。

F-2.5%-120%、F-2.5%-140%、F-2.5%-160%、F-2.5%-180%、F-2.5%-200%系列纖維在釋放的初始時期有明顯的突釋，然后藥物隨著時間的增加其釋放量緩慢增加。以往Poloxamer188復(fù)合聚L-乳酸電紡纖維對多西紫杉醇的釋放亦有明顯的突釋以及隨之的緩慢釋放，同時也有明顯的釋放平臺期，即該段時間內(nèi)藥物百分釋放量的增加幾乎為零。然而在本例中釋放曲線并沒有明顯的平臺期，這與以往的研究結(jié)果不同。在本系列纖維中，隨著Poloxamer188復(fù)合量的增高，多西紫杉醇的釋放量也逐漸增高，F(xiàn)-2.5%-200%的百分釋放量可達69.4%。F-2.5%系列纖維在釋藥的過程中一直無結(jié)晶和沉淀物出現(xiàn)，說明多西紫杉醇是以被Poloxamer188增溶的狀態(tài)釋放出纖維的。

F-2.5%-120% F-2.5%-140% F-2.5%-160% F-2.5%-180% F-2.5%-200%

F-5%-110% F-5%-120% F-5%-130% F-5%-140% F-5%-150%

F-5%-160% F-5%-170% F-5%-180% F-5%-190% F-15%-200%

F-10%-120% F-10%-140% F-10%-160% F-10%-180% F-10%-200%

(A) (B)

F-5%-110%、F-5%-120%、F-5%-130%、F-5%-140%、F-5%-150%系列纖維在釋放的初始時期有明顯的突釋，然后藥物隨著時間的增加其釋放量緩慢增加。本例中釋放曲線并沒有明顯的平臺期，同時釋放曲線除了突釋期外，在單位時間內(nèi)的增加量近乎相等，即釋放曲線可能被0級方程式擬合。此外還發(fā)現(xiàn)，隨著Poloxamer188復(fù)合量的增高，多西紫杉醇的百分釋放量逐漸降低，這與其他相似研究的結(jié)果相反。本系列纖維在突釋時間點時在釋放介質(zhì)中有結(jié)晶狀物質(zhì)存在，所以是采用與釋放介質(zhì)等體積的乙腈混合并渦旋溶解微晶體物質(zhì)進行含量測定的。發(fā)現(xiàn)該系列纖維藥物的百分釋放量很大程度上由突釋量決定，用672 h的百分釋放量減去8 h的百分釋放量后F-5%-110%、F-5%-120%、F-5%-130%、F-5%-140%、F-5%-150%的百分釋放量增量分別為37.8%、35.9%、33.4%、33.6%、30.2%，最大值與最小值的差值為7.6%，小于672 h時分別為78.5%、67.1%、64.4%、61.2%、58.3%時最大值與最小值20.2%的差值。這提示本系列纖維中的多西紫杉醇在纖維表面上有相當(dāng)多量的分布，而同時纖維表面上Poloxamer188的量并不能夠完全增溶此位置的多西紫杉醇，所以導(dǎo)致大量的多西紫杉醇以未增溶的形式釋放出纖維。此外，必須說明的是，在突釋時間段(0～8 h)，雖然在釋放介質(zhì)中含有大量的結(jié)晶，但是在此時的釋放介質(zhì)中也可能存在Poloxamer188增溶多西紫杉醇膠束。還有，從纖維中釋放出的結(jié)晶可能是多西紫杉醇，也可能是多西紫杉醇-Poloxamer188的復(fù)合物。

F-5%-160%、F-5%-170%、F-5%-180%、F-5%-190%、F-5%-200%系列纖維在釋放的初始時期有明顯的突釋，然后藥物隨著時間的增加其釋放量緩慢增加，在300 h之后進入平臺期，這與以往的類似研究相似。在本系列纖維中，隨著Poloxamer188復(fù)合量的增高，多西紫杉醇的釋放量也逐漸增高，F(xiàn)-5%-200%的百分釋放量可達59.5%。該5種纖維在釋藥的過程中一直無結(jié)晶和沉淀物出現(xiàn)，說明多西紫杉醇是以被Poloxamer188增溶的狀態(tài)釋放出纖維的。

F-10%-120%、F-10%-140%、F-10%-160%、F-10%-180%、F-10%-200%系列纖維在釋放的初始時期有明顯的突釋，然后藥物隨著時間的增加其釋放量緩慢增加，且在168 h后進入平臺期，是本文研究的纖維中最早進入平臺期的。當(dāng)纖維中Poloxamer188的復(fù)合量逐漸增加時，多西紫杉醇的百分釋放量逐漸增加。F-5%-200%的百分釋放量可達71.0%。該5種纖維在突釋期有結(jié)晶出現(xiàn)，隨之以多西紫杉醇被增溶的方式釋放藥物。

綜上所述，在Poloxamer188復(fù)合量從100%升至200%、多西紫杉醇載量從2.5%升至5%和10%后，多西紫杉醇從纖維中的釋放行為及釋放形態(tài)呈現(xiàn)若干規(guī)律：(1)當(dāng)多西紫杉醇載量一定時，隨著Poloxamer188在纖維中復(fù)合量的增高，纖維中的藥物釋放量逐漸增高，這可能是Poloxamer188提高了纖維的親水性和其本身釋放后導(dǎo)致纖維中親水微通道增大增多的結(jié)果，該現(xiàn)象在以往相類似的研究中有報道，但是F-5%-110%、F-5%-120%、F-5%-130%、F-5%-140%、F-5%-150%系列纖維是例外；(2)當(dāng)Poloxamer188復(fù)合量一定時，隨著纖維中多西紫杉醇復(fù)合量的增加，其本身的釋放量逐漸減少，引起該現(xiàn)象的原因為水不溶多西紫杉醇載量的升高會減少纖維的親水性，同時逐漸升高的多西紫杉醇載量也會消耗Poloxamer188對其進行結(jié)合與增溶，兩者都會導(dǎo)致藥物在纖維中移出和釋放的減慢；(3)Poloxamer188的復(fù)合量與多西紫杉醇的載量比例的變化對多西紫杉醇的釋放狀態(tài)有明顯影響，當(dāng)多西紫杉醇較低時(2.5%)，所考察的5種纖維的多西紫杉醇在釋放全程均為被增溶狀態(tài)，當(dāng)多西紫杉醇較高時(10%)，所考察的5種纖維的多西紫杉醇在釋放初期均為結(jié)晶態(tài)。當(dāng)多西紫杉醇載量為5%時，在Poloxamer188復(fù)合量較低時(110%～150%)，在釋放初期有結(jié)晶出現(xiàn)，在Poloxamer188復(fù)合量較高時(160%～200%)，在整個釋放期間均無結(jié)晶出現(xiàn)，即隨著Poloxamer188復(fù)合量的增高，其過渡到完全被增溶釋放的狀態(tài)。

關(guān)于載多西紫杉醇Poloxamer188復(fù)合聚L-乳酸電紡纖維已有一些報道，這些研究中多西紫杉醇的載量從2.5%直至25%，同時Poloxamer188的復(fù)合量設(shè)定在100%以下。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了若干規(guī)律。當(dāng)多西紫杉醇載量較少時(2.5%)其可以從纖維中以被增溶的狀態(tài)釋放，但是釋放量沒有本文Poloxamer188復(fù)合量增加到100%以上的多，本文2.5%載藥量系列纖維最大百分釋放量(69.4%)為2.5%載藥量、Poloxamer188復(fù)合量小于100%系列纖維最大百分釋放量(33.8%)的2倍。當(dāng)多西紫杉醇載量較多時(10%)，則在釋放初始階段為結(jié)晶狀態(tài)，并且如果此時Poloxamer188復(fù)合量較少(<100%)，則結(jié)晶狀態(tài)釋放持續(xù)的時間較長可達在8 h，而如果此時Poloxamer188復(fù)合量較多(100%～200%)，則結(jié)晶狀態(tài)釋放持續(xù)的時間較短，均小于2 h。當(dāng)多西紫杉醇載量為5%，Poloxamer188復(fù)合量在10%～100%時僅在0.5 h有結(jié)晶狀態(tài)，Poloxamer188復(fù)合量在110%～150%時亦僅在0.5 h有結(jié)晶狀態(tài)，Poloxamer188復(fù)合量在160%～200%時則在釋放全程均為被增溶狀態(tài)，即多西紫杉醇載量在5%時，其釋放狀態(tài)隨著Poloxamer188復(fù)合量的增加其有一個狀態(tài)的過渡。

表2 系列纖維釋放曲線Peppas方程式變換式lgQt/Qreleased=nlgt+lgk擬合結(jié)果

表2給出了系列釋放曲線對Peppas方程式的擬合的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)R2值均較高。此外還發(fā)現(xiàn)，除了F-5%-110%、F-5%-120%、F-5%-130%、F-5%-140%、F-5%-150%系列纖維，其他系列纖維的n值隨著載藥量的增高降低，每組纖維中隨著Poloxamer188復(fù)合量的增高k值逐漸增高。

n值與體系的維度相關(guān)，經(jīng)典理論指出當(dāng)維度降低時n值增大，在本實驗中所有纖維除直徑有所差別外，其微觀形態(tài)均為超細纖維，故從體系形態(tài)上去解釋該值很難得到對釋放機理的理解。n值是呈線性關(guān)系的lgt-lgQt/Qreleased回歸方程中的斜率，可以歸屬為被釋放速率影響的數(shù)值，顯然隨著纖維中多西紫杉醇載量的升高，其釋放速率變慢。在Peppas方程式中，影響k值的因素很多，但是彎曲因子的降低和基質(zhì)中藥物載量的增高這兩個因素必然會導(dǎo)致k值增大。但是可以發(fā)現(xiàn)，在本實驗所考察的纖維中，隨著載藥量的增高，k值反而下降，所以k值的增加應(yīng)該只由彎曲因子的降低這一因素所引起。能構(gòu)筑并保持內(nèi)部彎曲結(jié)構(gòu)通道結(jié)構(gòu)的一般為水不溶的高分子聚合物，在本實驗中為聚L-乳酸。而作為非聚合物的、可以釋放至介質(zhì)的小分子藥物是不能構(gòu)筑穩(wěn)固基質(zhì)的，水溶的Poloxamer188亦會釋放相當(dāng)比例所以也難以構(gòu)筑基質(zhì)。所以釋放曲線擬合結(jié)果提示Poloxamer188復(fù)合量的增高會導(dǎo)致纖維基質(zhì)中的親水部分比例變大進而發(fā)生合并，導(dǎo)致親水通道變粗、曲折性變低，k值增加[17]，該機理的示意圖見圖3。

圖3 多西紫杉醇釋放曲線擬合k值變化機理示意圖

4 結(jié) 論

本文在原有研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)以質(zhì)均分子量15萬的聚L-乳酸為成纖維材料，在Poloxamer188復(fù)合聚L-乳酸電紡纖維中繼續(xù)提高Poloxamer188的比例從100%直至200%，考察了載藥量為2.5%、5%、10%三個系列共20種纖維。所得纖維直徑均一、無珠子結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)載藥量較小(2.5%)時在整個釋放周期多西紫杉醇均為被增溶狀態(tài)釋放；當(dāng)載藥量較大(10%)時，在釋放初期仍然有結(jié)晶狀態(tài)的藥物；當(dāng)載藥量處于較高和較低之間值(5%)時，當(dāng)Poloxamer188的復(fù)合量在較低值(110%～150%)時，在釋放初期有結(jié)晶狀態(tài)物質(zhì)，在較高值(160%～200%)時，整個釋放周期多西紫杉醇均以被增溶的狀態(tài)釋放。隨著載藥量的降低，藥物的百分釋放量達到并超過了60%。

以上研究結(jié)果為進一步研究載多西紫杉醇Poloxamer188復(fù)合聚L-乳酸電紡纖維中多西紫杉醇載量、Poloxamer188復(fù)合量對藥物釋放行為的進一步研究提供了思路：今后的研究應(yīng)該繼續(xù)升高Poloxamer188在纖維中的占比，這樣多西紫杉醇的百分釋放量可能會繼續(xù)增高，同時在相當(dāng)高比例多西紫杉醇載量的情況下其亦可以在全釋放過程都為被增溶方式。這樣便可以使得該多西紫杉醇新劑型具有開發(fā)和實際應(yīng)用的價值。