lncRNA HOTAIRM1與miR-125b對肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為影響

李玉強(qiáng)，李男，吳彬，孫溶勵(lì)，趙明洲，楊微微，張佳林，蔣磊

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

在全球范圍內(nèi)，肝癌是第二大最常見的癌癥死亡原因，肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的(85～90)%，每年會(huì)導(dǎo)致超過700 000例病人死亡[1]。它通常是一種侵襲性的惡性腫瘤，預(yù)后較差，五年生存率估計(jì)低于9%。包括肝切除，肝移植和經(jīng)皮消融在內(nèi)的外科手術(shù)被認(rèn)為是治療肝癌最有效的方法。不幸的是，由于存在大量病變和肝外轉(zhuǎn)移，只有約20%的肝癌患者適合手術(shù)[2]。雖然靶向藥物和免疫療法的發(fā)現(xiàn)，給肝癌治療帶來了巨大的突破。但目前肝癌的治療顯然還不盡如人意，肝癌患者的化學(xué)治療藥物也是有限的[3]，特別是對于我國這樣的肝癌大國來說，更為有效的肝癌藥物和肝癌療法成為了迫切需求。因此，如何進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制并找到可以更有效地阻斷這種進(jìn)展性疾病的新靶標(biāo)至關(guān)重要。

長非編碼RNA(lncRNA)是一組長度大于200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼RNA[4]。越來越多的證據(jù)表明，可能作為癌基因或抑癌基因的lncRNA在人類疾病的病理生理中，尤其是在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[5]。microRNA(縮寫為miRNA)是一種小的非編碼RNA分子(包含約22個(gè)核苷酸)，存在于植物，動(dòng)物和某些病毒中，在RNA沉默和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起作用[6-9]。最近的研究表明，miRNA可以通過調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生有關(guān)的過程來充當(dāng)人類癌癥中的癌基因或腫瘤抑制物[10-11]。miR-125b是致癌基因miRNA之一，與多種腫瘤有關(guān)，而HOTAIRM1是miR-125b的分子海綿，它調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。因此本研究主要是探討lncRNA HOTAIRM1是否可以通過靶向miR-125b相互作用來調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移，研究其表達(dá)改變的情況及其可能發(fā)生的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Transwell小室(Corning公司)； Enhanced Cell Counting Kit-8(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Dual-Luciferase?Reporter Assay System(Promega，美國)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)； hsa-mir-125b-1慢病毒、HOTAIRM1引物、LV-HOTAIRM1-RNAi干擾慢病毒、LV- HOTAIRM1過表達(dá)慢病毒(上海康朗生物科技有限公司構(gòu)建和包裝)。超微量紫外分光光度儀(NanoDROP2000，美國Thermo公司)；聚丙烯酰胺凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS+，美國伯樂醫(yī)療)；普通PCR儀(C1000 Touch，美國伯樂醫(yī)療)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Mx3000P，Agilent)。

1.2 研究對象

1.2.1 細(xì)胞：HEPG2(HB-8065)細(xì)胞購置于ATCC，LO2和HCC-LM3由中國醫(yī)科大學(xué)肝膽外科實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，都具有STR驗(yàn)證報(bào)告。

1.2.2 組織樣本與資料：選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科和錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心2018年1月至2020年10月期間100例經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)過病理診斷確診為肝細(xì)胞癌的組織樣本，我們的排除標(biāo)準(zhǔn)是曾經(jīng)患有其它惡性腫瘤及接受過輔助放化療病史的樣本。統(tǒng)計(jì)資料包括年齡、性別、甲胎蛋白、腫瘤分化程度、肝癌的病理分期等。

1.2.3 血液樣本與資料：選取錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心2018年1月至2020年10月期間，肝血管瘤患者的血液樣本48例，肝囊腫血液樣本6例，共54例肝臟良性病變的血液樣本；肝惡性腫瘤的血液樣本54例,作為研究對象。

1.3 組織、血液及細(xì)胞樣本RNA提取

組織、血液及細(xì)胞樣本RNA的提取采用OMEGA提取試劑盒，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測RNA的濃度。

1.4 lncRNA HOTAIRM1與miR-125b熒光定量PCR

lncRNA HOTAIRM1和miR-125b引物由上海康朗生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。HOTAIRM1反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min(1個(gè)循環(huán))，95 ℃ 3 min(1個(gè)循環(huán))，95 ℃ 15 s+95 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))，95 ℃ 1 min+55 ℃ 30 s+95 ℃ 30 s(1個(gè)循環(huán)，兩步驟中間收集信號(hào))。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線、CT值等，結(jié)果采用2-△△Ct方法，將GAPDH作為參考基因，確定HOTAIRM1的相對表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。miR-125b反應(yīng)條件：50 ℃ 15 min(1個(gè)循環(huán))，94 ℃ 20 s+60 ℃ 34 s(40個(gè)循環(huán))，95 ℃ 1 min+55 ℃ 30 s+95 ℃ 30 s(1個(gè)循環(huán)，兩步驟中間收集信號(hào))。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線、溶解曲線、CT值等，結(jié)果采用2-△△Ct方法，將U6作為參考基因，確定miR-125b的比較表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 HOTAIRM1、GAPDH、miR-125b及U6的引物序列

1.5 慢病毒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

LV-HOTAIRM1-RNAi的干擾慢病毒、LV-HOTAIRM1過表達(dá)慢病毒以及LV-hsa-mir-125b-1過表達(dá)慢病毒由上?？道噬锟萍加邢薰緲?gòu)建和包裝，感染LO2、HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞后摸索出MOI和最佳的感染條件。

病毒轉(zhuǎn)染后按照不同培養(yǎng)條件分為5組：M組：含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基+慢病毒；A組：含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基+慢病毒+HiTransG A組，觀察HiTransG A是否可以提升感染效果；P組：含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基+慢病毒+HiTransG P組，觀察HiTransG P是否可以提升感染效果；陰性對照組：含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基+陰性對照病毒，和目的病毒做對比，觀察目的病毒感染細(xì)胞之后產(chǎn)生什么樣的變化；空白對照組：含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞生長是否正常。

1.6 lncRNA HOTAIRM1靶向miRNA預(yù)測

為了研究HOTAIRM1在肝癌進(jìn)展中的詳細(xì)機(jī)制，我們使用StarBase 2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測HOTAIRM1的靶向miRNA。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將野生型HOTAIRM1和突變型HOTAIRM1序列(miR-125b結(jié)合位點(diǎn)突變)克隆到pmirGLO質(zhì)粒中。pmirGLO-HOTAIRM1或pmirGLO-HOTAIRM1-mut通過Lipofectamine 2000與miR-125b模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染。將重組載體與miR-NC或miR-125b模擬物共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染48 h后，棄掉原培養(yǎng)基，用100 μL PBS洗滌培養(yǎng)孔1遍，吸盡剩余的PBS；使用去離子水將5×PLB稀釋成l×PLB；向96孔板中加入50 μL 1×PLB，裂解細(xì)胞15 min；96孔酶標(biāo)板中(白色不透光的)每孔加上步驟的上清液10 μL，再加入100 μL LARII，靜止2 s；每孔加入Stop&Glo Reagent終止反應(yīng)，靜止2 s后，進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

用記號(hào)筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5～1 cm劃1道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個(gè)HEPG2和HCC-L3細(xì)胞，用構(gòu)建的慢病毒LV-RIZ1-RNAi，LV-HOTAIRM1-RNAi，LV-HOTAIRM1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。當(dāng)在鏡下觀察HEPG2和HCC-L3細(xì)胞鋪滿后，用200 μL的黃槍頭比著直尺劃垂直線。用槍頭將D-PBS緩慢加入6孔板中，緩慢清洗3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、12、24、36、48 h在顯微鏡下拍照記錄。

1.9 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用Matrigel matrix基質(zhì)膠對Transwell小室進(jìn)行制備。取100 μL細(xì)胞懸液加入Transweel小室(上室)，下室加0.5 mL含10%FBS的培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)10～24 h，吸取上室殘液，PBS清洗兩遍，下室加入0.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min后吸去。風(fēng)干后下室加入0.5 mL 0.1%結(jié)晶紫染色20 min；小室風(fēng)干后正立置于干凈載玻片上，顯微鏡物鏡調(diào)至200倍鏡，每個(gè)孔取8個(gè)視野拍照。

1.10 CCK8實(shí)驗(yàn)

在96孔板中加入100 μL的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育一段時(shí)間(0、24、48、72 h)。向每孔加入10 μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(1～4)h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.11 細(xì)胞凋亡檢測

收集細(xì)胞懸液，1000轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5～10萬重懸的細(xì)胞，1000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。立即進(jìn)行檢測，確定細(xì)胞的凋亡情況。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism8 V8.02和SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組樣本采用配對樣本t檢驗(yàn)，所有計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)3次，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 預(yù)測HOTAIRM1的靶miRNA

我們使用StarBase 2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測HOTAIRM1的靶miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-125b可能是HOTAIRM1的靶miRNA，見圖1。

圖1 HOTAIRM13’UTR中預(yù)測的miR-125b結(jié)合位點(diǎn)

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

我們構(gòu)建了HOTAIRM1-wt熒光素酶報(bào)告基因載體和HOTAIRM1-mut 3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，并進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因分析。結(jié)果表明，miR-125b過表達(dá)導(dǎo)致HOTAIRM1-WT的熒光素酶活性顯著降低，而HOTAIRM1-MUT則沒有。這些結(jié)果證明了，HOTAIRM1的靶標(biāo)是miR-125b，見圖2。

圖2 熒光素酶法檢測miR-125b對HOTAIRM1-WT和HOTAIRM1-MUT報(bào)告分子熒光素酶活性的影響

2.3 慢病毒對HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞的感染MOI和最佳感染條件

2.3.1 LV-HOTAIRM1慢病毒感染的MOI和最佳感染條件

用LV-HOTAIRM1慢病毒轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞，MOI=20，最佳感染條件為：LV-HOTAIRM1慢病毒+HiTransG P組，見圖3。

圖3 LV-HOTAIRM1慢病毒轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞最佳感染組

2.3.2 LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒感染的MOI和最佳感染條件

用LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，MOI=10，最佳感染條件為：LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒+HiTransG P組，見圖4。

圖4 LV-OTAIRM1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞最佳感染組

2.3.3 LV-hsa-mir-125b-1慢病毒感染的MOI和最佳感染條件

用LV-hsa-mir-125b-1慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞，HEPG2人肝癌細(xì)胞MOI=10，最佳感染條件為：LV-hsa-mir-125b-1慢病毒+HiTransGA組，見圖5；HCC-LM3人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MOI=20，最佳感染條件為：LV-hsa-mir-125b-1慢病毒+HiTransGA組，見圖6。

圖5 LV-hsa-mir-125b-1慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞最佳感染組

圖6 LV-hsa-mir-125b-1慢病毒轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞最佳感染組

2.3.4 LV-HOTAIGXRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒共感染的MOI和最佳感染條件

用LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞MOI=10，最佳感染條件為：LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒+HiTransGA組，見圖7。

圖7 LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞最佳感染組

2.3.5 LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒共感染的MOI和最佳感染條件

用LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞MOI=20，最佳感染條件為：LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒+HiTransGP組，見圖8。

圖8 LV-HOTAIRM1 +LV-hsa-mir-125b-1慢病毒共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞最佳感染組

2.4 HOTAIRM1表達(dá)與miR-125b表達(dá)之間的關(guān)系

用LV-HOTAIRM1慢病毒轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞或用LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞。結(jié)果表明，HOTAIRM1的過表達(dá)顯著抑制了miR-125b的表達(dá)，而HOTAIRM1的下調(diào)則反向支持了肝細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)(*P<0.05)，見圖9～10。

圖9 LV-HOTAIRM1轉(zhuǎn)染后miR-125b在HCC-LM3細(xì)胞中的表達(dá)水平

圖10 LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染后miR-125b在HEPG2細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.5 HOTAIRM1干擾和miR-125b過表達(dá)共同作用對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，HOTAIRM1在HEPG2細(xì)胞中的下調(diào)表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞增殖，侵襲和遷移和miR-125b過表達(dá)共同作用進(jìn)一步促進(jìn)了HEPG2細(xì)胞增殖、侵襲、遷移(*P<0.05，**P<0.01)，見圖11～13。

圖11 LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞后增殖情況

圖12 LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞后侵襲情況

圖13 LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞后的遷移能力

2.6 HOTAIRM1過表達(dá)和miR-125b過表達(dá)共同作用對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲、和遷移的影響

LV-HOTAIRM1+miR-125b共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞，結(jié)果表明，HOTAIRM1的過表達(dá),抑制了HCC-LM3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并且可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)HOTAIRM1和miR-125b的共轉(zhuǎn)染結(jié)果(*P<0.05，**P<0.01)，見圖14～16。

圖14 LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞后增殖情況

圖15 LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞后侵襲情況

圖16 LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞后的遷移情況

2.7 科室組織樣本中HOTAIRM1和miR-125b在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達(dá)情況

選擇科室100例配對的肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常組織進(jìn)行qRT-PCR結(jié)果采用2-△△Ct方法，將GAPDH 或U6作為參考基因，確定miR-125b和HOTAIRM1的相對表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。發(fā)現(xiàn)HOTAIRM1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁和正常組織，而正常組織與癌旁組織相比差異不大(*P<0.05，**P<0.01)，見圖17。發(fā)現(xiàn)miR-125b在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁和正常組織，而癌旁和正常組織之間無明顯的差異，見圖18。

圖17 HOTAIRM1在肝細(xì)胞癌組織樣本中的表達(dá)情況

圖18 miR-125b在肝細(xì)胞癌組織樣本中的表達(dá)情況

2.8 科室血液樣本中HOTAIRM1和miR-125b的表達(dá)情況

收集108例患者作為研究對象進(jìn)行qRT-PCR采用2-△△Ct方法，確定HOTAIRM1和miR-125b的相對表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者血液樣本中HOTAIRM1表達(dá)量比正?；颊弑磉_(dá)量低，miR-125b表達(dá)量比正?；颊叩谋磉_(dá)量高(*P<0.05)，見圖19～20。

2.9 LO2、HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞中HOTAIRM1和miR-125b的表達(dá)情況

研究結(jié)果表明HOTAIRM1在HCC-LM3和HEPG2細(xì)胞中的表達(dá)比LO2細(xì)胞低(*P<0.05)，見圖21；miR-125b在HCC-LM3和 HEGP2細(xì)胞中的表達(dá)比LO2細(xì)胞高(*P<0.05)，見圖22。

圖19 血液樣本中HOTAIRM1的表達(dá)情況

圖20 血液樣本中miR-125b的表達(dá)情況

圖21 LO2、HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞中HOTAIRM1的表達(dá)情況

圖22 miR-125b在 LO2、HEPG2、HCC-LM3細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2.10 科室組織樣本中HOTAIRM1和miR-125b的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

分析發(fā)現(xiàn)HOTAIRM1的表達(dá)情況與患者腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān)，但其與患者年齡、性別、乙肝、肝硬化、AFP、門靜脈癌栓、腫瘤分化程度及TNM分期等因素?zé)o明顯相關(guān)性(*P<0.05)，見表2。

分析發(fā)現(xiàn)miR-125b的表達(dá)情況與患者乙肝、腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān)，但其與患者年齡、性別、肝硬化、AFP、門靜脈癌栓、腫瘤分化程度及TNM分期等因素?zé)o明顯相關(guān)(*P<0.05)，見表3。

表2 利用科室組織樣本分析HOTAIRM1表達(dá)水平與組織臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系(n，%)

表3 利用科室組織樣本分析miR-125b表達(dá)水平與組織臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系(n，%)

3 討 論

肝癌對人類健康和生命有嚴(yán)重的威脅。原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床表現(xiàn)極為不典型，癥狀通常不明顯，尤其是在疾病的早期[12]。盡管近年來肝癌的生存率有所提高，但仍然不容樂觀[13]。HOTAIRM1(HOTAIR myeloid specific 1)又可以稱為HOXA-AS1，HOXA1-AS1，NCRNA00179，是從HOXA簇轉(zhuǎn)錄的一個(gè)483bp的lncRNA，在髓系中表達(dá)。lncRNA HOTAIRM1在乳腺癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性腫瘤、卵巢癌細(xì)胞、急性髓細(xì)胞性白血病、甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞、骨關(guān)節(jié)炎、胰腺導(dǎo)管腺癌以及肝癌的發(fā)生發(fā)展中都起到了非常重要的作用[14-18]。miR-125b是致癌基因miRNA之一，與多種腫瘤有關(guān)，而HOTAIRM1是miR-125b的分子海綿，它調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

為了研究HOTAIRM1在肝癌進(jìn)展中的詳細(xì)機(jī)制，我們使用StarBase 2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測HOTAIRM1的靶miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-125b可能是HOTAIRM1的靶miRNA。然后，我們構(gòu)建了HOTAIRM1-wt熒光素酶報(bào)告基因載體和HOTAIRM1-mut3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，并進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因分析。結(jié)果表明，miR-125b過表達(dá)導(dǎo)致HOTAIRM1-WT的熒光素酶活性顯著降低，而HOTAIRM1-MUT則沒有。這些結(jié)果證明了miR-125b是HOTAIRM1的靶miRNA。此外，HOTAIRM1的過表達(dá)顯著抑制了miR-125b的表達(dá)，而HOTAIRM1的下調(diào)則反向支持了肝癌細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HOTAIRM1在肝癌進(jìn)展中的作用是否由miR-125b介導(dǎo)，我們使用LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，HOTAIRM1在HEPG2細(xì)胞中的下調(diào)表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，和miR-125b過表達(dá)共同作用進(jìn)一步促進(jìn)了HEPG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。LV-HOTAIRM1+miR-125b慢病毒共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞，HOTAIRM1的過表達(dá)抑制了HCC-LM3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并且可以逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)HOTAIRM1和miR-125b的共轉(zhuǎn)染結(jié)果。

我們利用科室收集的樣本，通過研究發(fā)現(xiàn)HOTAIRM1在肝細(xì)胞癌患者癌組織樣本、血液樣本和HCC-LM3人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯下降。我們分析了HOTAIRM1的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，分析發(fā)現(xiàn)HOTAIRM1的表達(dá)情況與患者腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān)，即HOTAIRM1高表達(dá)與HOTAIRM1低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織相比，其腫瘤體積相對較小，腫瘤數(shù)目相對較少；但其與患者年齡、性別、乙肝、肝硬化、AFP、門靜脈癌栓、腫瘤分化程度及TNM分期等因素?zé)o明顯相關(guān)性。我們對本科室收集的組織樣本分析表明，miR-125b在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁和正常組織，而癌旁和正常組織之間無明顯的差異。對本科室收集的血液樣本分析表明，肝細(xì)胞癌患者血液樣本中miR-125b表達(dá)量比正?；颊叩谋磉_(dá)量高。分析發(fā)現(xiàn)miR-125b的表達(dá)情況與患者乙肝、腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān)，即miR-125b高表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織與miR-125b低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織相比，其腫瘤體積相對較大，腫瘤數(shù)目相對較多；乙肝陽性患者中miR-125b高表達(dá)的多，乙肝陰性患者中miR-125b低表達(dá)的多，但其與患者年齡、性別、肝硬化、AFP、門靜脈癌栓、腫瘤分化程度及TNM分期等因素?zé)o明顯相關(guān)。所有這些數(shù)據(jù)表明，HOTAIRM1通過下調(diào)miR-125b阻斷了肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIRM1可以通過靶向miR-125b來調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移，這可以進(jìn)一步影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。從而為肝癌的治療提供新的靶標(biāo)和思路。