卵巢早衰病人血清微小RNA-125b表達(dá)及與中醫(yī)證型的相關(guān)性分析

李海霞，李慧朋，王文文

作者單位：鄭州市第七人民醫(yī)院，a婦科，b中醫(yī)科，c藥學(xué)部，河南 鄭州450016；

卵巢早衰是臨床常見的婦科內(nèi)分泌疾病之一，也是引起卵巢儲備功能異常的主要疾病之一，其發(fā)病趨勢呈現(xiàn)明顯年輕化［1］。卵巢早衰發(fā)病率占原發(fā)性閉經(jīng)的20%～28%，約占繼發(fā)性閉經(jīng)的4%～20%，可導(dǎo)致生殖器萎縮，增加骨質(zhì)丟失、心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，甚至造成女性喪失生殖能力，嚴(yán)重影響女性身心健康［2］。研究表明，卵巢早衰與卵泡數(shù)量減少有關(guān)［3］。有研究報(bào)道，微小RNA（miR）-125b 在多囊卵巢綜合征病人卵泡中表達(dá)上調(diào)［4］，中樞性性早熟女童血清miR-125b 表達(dá)水平異?？捎糜谠u估乳房發(fā)育情況［5］。VICTORIA 等［6］研究證實(shí)，抗米勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）可在一定程度上反映卵巢功能，而卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）是臨床常用卵巢早衰診斷檢測指標(biāo)［7］。由于血清miR-125b在卵巢早衰中表達(dá)水平報(bào)道較為少見，本研究旨在探討卵巢早衰病人血清miR-125b 表達(dá)水平，通過分析miR-125b 表達(dá)與AMH、FSH/LH 及中醫(yī)證型的關(guān)系，以期為卵巢早衰臨床治療提供一定理論幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017 年3 月至2019 年6 月鄭州市第七人民醫(yī)院婦科收治的136例卵巢早衰病人作為研究對象（研究組），研究組年齡（35.23±1.37）歲，范圍為28～39 歲；體質(zhì)量指數(shù)（23.01±0.83）kg/m2，范圍為20～25 kg/m2；西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照曹澤毅主編《中華婦產(chǎn)科學(xué)》［8］（第三版）中診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［9］制定的標(biāo)準(zhǔn)，其中中醫(yī)辨證分型診斷標(biāo)準(zhǔn)主要參考《中醫(yī)婦科學(xué)》［10］、《中醫(yī)診斷學(xué)》［11］及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［9］中分型標(biāo)準(zhǔn)：有肝腎陰虛證、腎虛肝郁證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證。

另選取同期120 例該院體檢健康者作為對照組，年齡（35.45±1.46）歲，范圍為26～39歲；體質(zhì)量指數(shù)（23.09±0.85）kg/m2，范圍為20～26 kg/m2，兩組研究對象年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.24、0.76，P=0.215、0.447）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合上述卵巢早衰中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡<40 歲；（3）閉經(jīng)超過4 個(gè)月；（4）至少2 次（間隔時(shí)間>1 個(gè)月）血清FSH>40 IU/L，雌二醇<73.2 pmol/L；（5）病人知情，簽署知情同意書；（6）該研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）近1 年有激素治療史者；（2）伴多囊卵巢綜合征及其他卵巢疾病者；（3）先天性生殖器官發(fā)育不全者；（4）伴嚴(yán)重心、肝、腎等器官原發(fā)性疾病者；（5）伴惡性腫瘤者；（6）泌乳素異常者；（7）甲狀腺功能異常者；（8）伴糖尿病、高血壓及血液疾病者；（9）精神疾病者。

1.4 樣本采集及檢驗(yàn)收集所有研究對象（未閉經(jīng)者在月經(jīng)期2～3 d，閉經(jīng)者無時(shí)間限定）清晨空腹靜脈血5 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，分離上清，超低溫凍存待檢。（1）血清AMH 水平檢測；（2）采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測血清miR-125b 表達(dá)水平，試劑盒購自大連寶生物技術(shù)有限公司。20 μL 反應(yīng)體系如下：ROX 0.4μL，Mix 10μL，cDNA 2μL，正、反向引物各2μL，無酶水3.6μL。反應(yīng)步驟如下：95 ℃，7 min，1循環(huán)；95 ℃，15 s；63 ℃，35 s；72 ℃，18 s；40 循環(huán)，一個(gè)樣品3次重復(fù)。以U6為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-125b 表達(dá)水平；（3）采用酶聯(lián)免疫吸附測定檢測血清AMH水平，AMH試劑盒由美國Epitope Di?agnostics 公司提供，全自動酶標(biāo)儀購自意大利Bio?base 公司，具體步驟參照試劑盒說明書操作；（4）采用電化學(xué)發(fā)光法檢測FSH、LH 水平，試劑盒、化學(xué)發(fā)光分析儀購自美國雅培公司，室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)均在控，由同一實(shí)驗(yàn)員完成上述檢驗(yàn)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料行正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，采用±s描述，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析（采用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩間比較）；計(jì)數(shù)資料用（%）描述，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)性分析檢驗(yàn)血清miR-125b 與AMH、FSH/LH 比值關(guān)系，通過logistic 回歸分析探討血清miR-125b、AMH、FSH/LH 對卵巢早衰不同中醫(yī)證型影響。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢早衰病人中醫(yī)證型分布情況136例卵巢早衰病人中腎虛肝郁證56例（41.18%），肝腎陰虛證32 例（23.53%），腎虛血瘀證23 例（16.91%），脾腎陽虛證20例（14.70%），其他5例（3.68%）。

2.2 兩組病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比較研究組病人血清AMH 水平明顯低于對照組（P<0.05），miR-125b、FSH、LH、FSH/LH比值明顯高于對照組（P<0.05），見表1。

表1 體檢健康者與卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

表1 體檢健康者與卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

注：AMH為抗米勒管激素，F(xiàn)SH為卵泡刺激素，LH為黃體生成素。

組別對照組研究組t值P值FSH/LH 1.05±0.31 1.62±0.52 10.48<0.001例數(shù)120 136 miR-125b 1.01±0.29 2.67±0.91 19.14<0.001 AMH/（pmol/L）10.95±2.62 1.98±0.64 38.65<0.001 FSH/（U/L）6.05±1.02 47.28±9.15 49.08<0.001 LH/（U/L）5.32±1.37 30.46±8.24 33.01<0.001

2.3 不同中醫(yī)證型病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比較四組不同中醫(yī)證型病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），肝腎陰虛證組病人血清AMH 水平低于腎虛肝郁證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證病人（P<0.05），脾腎陽虛證組低于腎虛血瘀證組（P<0.05）；肝腎陰虛證組病人miR-125b、FSH、LH 水平高于腎虛肝郁證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證病人（P<0.05），脾腎陽虛證組miR-125b、FSH、LH 水平高于腎虛血瘀證、腎虛肝郁證組（P<0.05）；肝腎陰虛證組病人FSH/LH 比值低于腎虛肝郁證、腎虛血瘀證病人（P<0.05），脾腎陽虛證組低于腎虛肝郁證病人（P<0.05）。見表2。

表2 不同中醫(yī)證型卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

表2 不同中醫(yī)證型卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

注：AMH為抗米勒管激素，F(xiàn)SH為卵泡刺激素，LH為黃體生成素。①與腎虛肝郁證比較，P<0.05。②與肝腎陰虛證比較，P<0.05。③與腎虛血瘀證比較，P<0.05。

組別腎虛肝郁證肝腎陰虛證腎虛血瘀證脾腎陽虛證F值P值FSH/LH 1.88±0.23 1.42±0.28①1.69±0.31①②1.58±0.36①19.62<0.001例數(shù)56 32 23 20 miR-125b 2.26±0.75 3.35±1.07①1.94±0.62①②2.73±0.93①②③15.94<0.001 AMH/（pmol/L）1.85±0.24 1.56±0.20①2.01±0.12①②1.72±0.28②③21.15<0.001 FSH/（U/L）43.28±5.11 52.95±3.26①42.73±4.51①②47.12±4.26①②③36.89<0.001 LH/（U/L）24.83±2.52 35.92±3.04①26.57±4.23①②30.79±4.34①②③82.34<0.001

2.4 卵巢早衰病人血清miR-125b 表達(dá)水平與AMH 水平、FSH/LH 比值相關(guān)性卵巢早衰病人血清miR-125b 表達(dá)水平與AMH 水平呈負(fù)相關(guān)（r=?0.470，P<0.001），與FSH/LH 比值呈正相關(guān)（r=0.502，P<0.001）。

2.5 卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH、FSH/LH與中醫(yī)證型的關(guān)系以miR-125b、AMH、FSH/LH 比值為自變量，中醫(yī)證型為因變量，引入logistic 多元回歸模型顯示，血清AMH 與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），miR-125b、FSH/LH比值與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證呈正相關(guān)（P<0.05），見表3。

表3 卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH、FSH/LH與中醫(yī)證型的關(guān)系

3 討論

3.1 卵巢早衰中醫(yī)病機(jī)及證型分析祖國醫(yī)學(xué)將卵巢早衰歸屬于“閉經(jīng)”“不孕”“血枯”“絕經(jīng)前后諸證”等范疇，《素問·上古天真論》最早提出“早衰”一詞，其曰“今時(shí)之人不然也……以忘為?！拾氚俣ヒ病?，《素問·陰陽應(yīng)象大論》亦有云：“能之七損八益……則早衰之節(jié)也。年四十而陰氣自半化，起居衰也?！蹦I虛為卵巢早衰發(fā)病病機(jī)，《傅青主女科》有“經(jīng)本于腎”“經(jīng)水出諸腎”之說，腎藏先天之精，天癸之源，主生殖，腎精充足則天葵生化有源，腎氣虧虛，精血匱乏，天癸竭，沖任虛衰，胞宮失所養(yǎng)。有學(xué)者認(rèn)為卵巢早衰病機(jī)以腎虛為主，清心滋腎可取得較佳治療效果［12］。本研究結(jié)果顯示，136例卵巢早衰病人腎虛肝郁證（41.18%）、肝腎陰虛證（23.53%）、腎虛血瘀證（16.91%）、脾腎陽虛證（14.70%）4 類證型均見腎虛，與滕秀香等［13］研究結(jié)果相似，提示腎虛可能在卵巢早衰發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位。

3.2 卵巢早衰病人血清miR-125b 及激素指標(biāo)水平分析本研究結(jié)果顯示，卵巢早衰病人miR-125b表達(dá)水平明顯高于對照組，提示血清miR-125b表達(dá)水平升高可能與卵巢早衰發(fā)生有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b 可通過與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B 特異性結(jié)合，促進(jìn)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡［14］。還有研究表明，miR-125b可通過靶向激活素受體2a調(diào)控新生小鼠卵巢原始卵泡形成［15］。而Chen 等［16］研究報(bào)道，miR-125b 過表達(dá)與卵巢細(xì)胞線粒體凋亡通路激活有關(guān)，上述結(jié)果均提示miR-125b可能通過調(diào)控卵泡相關(guān)基因表達(dá)，參與卵巢早衰發(fā)生過程。

進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Lannes 等［17］研究認(rèn)為，miR-125b 可通過神經(jīng)激素調(diào)節(jié)LH、FSH 表達(dá)水平，參與神經(jīng)元性疾病進(jìn)展。AMH 與轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）表達(dá)密切相關(guān)，有研究證實(shí)，胰腺導(dǎo)管腺癌進(jìn)展中miR-125b 可與TGF-β 相互作用，參與癌細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)程［18］。其中AMH 屬于TGF-β 超家族，其主要表達(dá)分泌部位為初級卵泡的顆粒細(xì)胞，隨卵泡增大而分泌減少，并隨年齡增長呈降低趨勢，在調(diào)控卵泡的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用［19］。李強(qiáng)等［20］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢功能衰退病人血清AMH水平降低，對其早期檢測可預(yù)測卵巢功能衰退。FSH 是卵巢早衰最敏感檢測指標(biāo)之一，臨床上將FSH>40 IU/L 時(shí)視為卵泡耗竭，當(dāng)卵巢功能異常時(shí)，血清FSH、LH 分泌調(diào)控會出現(xiàn)紊亂，與卵巢早衰發(fā)生密切相關(guān)［21］。本研究結(jié)果顯示，較于對照組，研究組病人血清AMH 水平降低，F(xiàn)SH、LH 水平及FSH/LH 比值升高，與陳紅男等［22］研究結(jié)果相似，提示血清AMH表達(dá)及FSH/LH 比值異?？赡芘c卵巢早衰發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，卵巢早衰病人血清miR-125b 表達(dá)水平與AMH 水平呈負(fù)相關(guān)，與FSH/LH 比值呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示血清miR-125b可能通過與AMH、FSH、LH等相關(guān)指標(biāo)或因子相互作用，促進(jìn)卵泡數(shù)量減少及功能異常發(fā)生，共同參與卵巢早衰進(jìn)展。

3.3 卵巢早衰中醫(yī)證型與血清miR-125b 及激素指標(biāo)的關(guān)系另外，本研究結(jié)果還顯示，血清miR-125b、AMH、FSH、LH及FSH/LH比值在肝腎陰虛證、脾腎陽虛證病人中表達(dá)差異較為明顯，提示血清miR-125b、AMH、FSH/LH 比值與卵巢早衰中醫(yī)證型中肝腎陰虛證、脾腎陽虛證的關(guān)系較為密切。中醫(yī)認(rèn)為腎內(nèi)藏真陰元陽，陽主動，為成熟卵子排出體內(nèi)的動力所在，而腎陰則為卵子生成、成熟提供物質(zhì)基礎(chǔ)，腎虛日久，腎陰陽失調(diào)，腎陰不足可導(dǎo)致卵泡形成障礙，而腎陽不足則影響排卵，導(dǎo)致排卵功能障礙，影響卵巢功能，肝腎為母子關(guān)系，而脾腎共主水液代謝，影響卵巢分泌功能［23-24］。因此，肝腎陰虛證、脾腎陽虛證卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH水平及FSH/LH 比值異常較明顯。最后研究發(fā)現(xiàn)，血清AMH與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證呈負(fù)相關(guān)，miR-125b、FSH/LH 比值與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證呈正相關(guān)，提示血清miR-125b、AMH 表達(dá)、FSH/LH 比值與卵巢早衰中醫(yī)證型相關(guān)，臨床上可通過檢測血清miR-125b、AMH 水平及FSH/LH 比值變化作為卵巢早衰中醫(yī)證分型輔助指標(biāo)，但是由于本研究僅從臨床角度淺顯地分析了二者之間的關(guān)系，后期將從分子生物學(xué)及基因組學(xué)等多個(gè)角度進(jìn)行探討中醫(yī)藥調(diào)控miR-125b對卵巢早衰的影響。

綜上所述，卵巢早衰病人血清miR-125b 高表達(dá)，與AMH、FSH/LH 比值異常變化有關(guān)，且肝腎陰虛證、脾腎陽虛證病人血清miR-125b水平變化較為明顯，與卵巢早衰中醫(yī)證型相關(guān)，但是由于本研究對象較少，且卵巢早衰病程較長其主觀癥狀隨病情變化而變化，可能影響中醫(yī)辨證分型，缺乏多中心研究，同時(shí)本研究僅從臨床角度探討血清miR-125b與卵巢早衰病人中醫(yī)證型的關(guān)系，關(guān)于二者之間的內(nèi)在機(jī)制以及是否存在中醫(yī)藥及基因調(diào)控miR-125b 尚不明確，還有待進(jìn)一步從基礎(chǔ)理論深入分析。