芍藥受體再生系統(tǒng)的建立

程 婉，康 靜

（沈陽城市學(xué)院，遼寧沈陽 110000）

植物遺傳轉(zhuǎn)化（plant genetic transformation）是應(yīng)用重組DNA 技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，有目的地將外源基因或DNA 片段插入到受體植物基因組中，并使其在后代植株中得以表達(dá)的過程[1]。植物遺傳轉(zhuǎn)化可以定向改變植物遺傳信息，改善育種進(jìn)程，提高植物抗性，獲得性狀良好的轉(zhuǎn)基因植物。建立高效的再生受體系統(tǒng)是基因遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，基因轉(zhuǎn)化需要有大量且質(zhì)量優(yōu)良的受體來接受外源基因的整合，通過鑒定有更多的受體實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)，從而篩選出轉(zhuǎn)基因再生植株。目前，由于芍藥間接途徑誘導(dǎo)不定芽困難，增殖較慢，直接途徑誘導(dǎo)不定芽數(shù)量少，不易再生，阻礙了芍藥在分子生物學(xué)上轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展，因此為芍藥建立高效、穩(wěn)定的受體系統(tǒng)迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

外植體：愈傷組織、芍藥試管苗的子葉；抗生素：潮霉素（Hygromycin）、慶大霉素（Gentamicin）、頭孢霉素、羧芐霉素。

1.2 選擇抗生素的確定

將芍藥試管苗的子葉接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L。將芍藥愈傷組織分成大小均勻小塊，接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上2 種培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度慶大霉素、潮霉素，觀察子葉不定芽生長情況和愈傷組織分化、褐化情況，確定遺傳轉(zhuǎn)化選擇壓和最佳轉(zhuǎn)化受體。

1.3 抑菌抗生素的確定

將芍藥試管苗的子葉接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L。將芍藥愈傷組織分割成大小均勻的小塊，接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上2 種培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度頭孢霉素（Cefotaxime）、羧芐霉素（Carbenicinin），觀察子葉不定芽生長情況和愈傷組織塊分化、褐化情況，確定遺傳轉(zhuǎn)化選擇壓和最佳的轉(zhuǎn)化受體。各種抗生素濃度見表1。

表1 抗生素濃度表

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

不定芽分化率（%）=分化的外植體/接種的外植體總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 子葉對抗生素種類和濃度的篩選

由表2 可知，在添加不同種類和濃度的選擇抗生素培養(yǎng)基中，子葉分化不定芽的效率不同。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在添加潮霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長較慢，隨著濃度的增大，子葉對潮霉素的敏感度不斷增大，分化率逐漸下降。結(jié)果表明，當(dāng)潮霉素濃度為2 mg/L 時，分化率最大為75.57%，但與空白對照相比，下降了11.33 百分點(diǎn)。當(dāng)潮霉素濃度為8mg/L 時，分化率較低，為2.67%；當(dāng)潮霉素濃度為10mg/L，分化率為0，且子葉生長勢較弱，出現(xiàn)萎蔫甚至死亡。所以，當(dāng)潮霉素濃度為8mg/L時，可作為芍藥遺傳轉(zhuǎn)化的選擇壓。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入慶大霉素時，不定芽在5mg/L 時分化只有7.76%，當(dāng)濃度為10mg/L 時，分化率為0，說明子葉對慶大霉素的敏感度過高，因此慶大霉素不適宜作為選擇抗生素。

表2 Hyg 和Gen 對子葉不定芽分化的影響

由表3 可知，在添加不同種類和濃度的抑菌抗生素培養(yǎng)基中，子葉分化不定芽效率均受到一定程度的抑制。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在添加頭孢霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長雖受到抑制，但是抗敏感度較高，當(dāng)濃度為50mg/L，分化率為71.1%，當(dāng)濃度達(dá)到150mg/L，依然有16.67%子葉可以分化不定芽。而在加入羧芐霉素的培養(yǎng)基中，當(dāng)濃度為50mg/L 時，分化率就已經(jīng)降低到38.9%，所以羧芐霉素不適宜作為抑菌抗生素，可選擇頭孢霉素50mg/L 作為芍藥遺傳轉(zhuǎn)化過程中的抑菌劑。

表3 抑菌抗生素對子葉不定芽分化的影響

2.2 愈傷組織對抗生素種類和濃度的篩選

由表4 可知，在添加不同種類和濃度的選擇抗生素培養(yǎng)基中，愈傷組織分化不定芽的效率不同。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在添加潮霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長較慢，隨著濃度的增大，子葉對潮霉素的敏感度不斷增大，分化率逐漸下降，褐化甚至死亡。結(jié)果表明，當(dāng)潮霉素濃度為2mg/L 時，分化率最大為68.9%，但與空白對照相比，下降了15.53%。當(dāng)潮霉素濃度為6mg/L 時，分化率較低，為6.67%；當(dāng)潮霉素濃度為8mg/L，分化率為0，且愈傷組織生長勢較弱，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重甚至死亡。所以，當(dāng)潮霉素濃度為6mg/L 時，可作為芍藥愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的選擇壓。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入10mg/L 慶大霉素時，不定芽分化只有5.57%；當(dāng)濃度為15mg/L 時，分化率為0，說明愈傷組織對慶大霉素的敏感度過高，所以慶大霉素不適宜作為選擇抗生素。

表4 選擇抗生素對愈傷組織不定芽分化的影響

由表5 可知，在添加不同種類和濃度的抑菌抗生素培養(yǎng)基中，愈傷組織分化不定芽效率均受到一定程度的抑制。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在添加頭孢霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長雖受到抑制，但是抗敏感度較高，當(dāng)濃度為100mg/L，分化率為71.1%，當(dāng)濃度達(dá)到200mg/L，依然有23.33%愈傷組織可以分化不定芽。而在加入羧芐霉素的培養(yǎng)基中，當(dāng)濃度為100mg/L 時，分化率就已經(jīng)降低到6.67%，所以羧芐霉素不適宜作為抑菌抗生素，可選擇頭孢霉素100mg/L 作為芍藥遺傳轉(zhuǎn)化過程中的抑菌劑。

表5 抑菌抗生素對愈傷組織不定芽分化的影響

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：子葉和愈傷組織對抗生素均較為敏感，都可作為良好的受體。當(dāng)以子葉為受體時，潮霉素的抗性質(zhì)量濃度為8mg/L；頭孢霉素為50mg/L 時，農(nóng)桿菌生長可完全受到抑制。以愈傷組織為受體時，潮霉素的抗性質(zhì)量濃度為6mg/L，頭孢霉素為100mg/L時，農(nóng)桿菌生長可完全受到抑制。

3.1 抗生素篩選對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最有效的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法之一，因其價格低廉、操作簡便、可導(dǎo)入的目的基因片段大、拷貝數(shù)低、不易發(fā)生重排、符合孟德爾遺傳定律等優(yōu)點(diǎn)，所以植物可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得大量的轉(zhuǎn)基因植物[2]。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，潮霉素和慶大霉素常被用作抗性選擇壓的篩選。頭孢霉素和羧芐霉素常被用作抑制農(nóng)桿菌過度生長的抑菌劑。由于不同種類抗生素在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中所起到的作用不同，不同濃度抗生素對農(nóng)桿菌的抑制效果不同，不同種類植物和外植體對抗生素的敏感反應(yīng)也存在差異。在培養(yǎng)基中添加抗生素后，抗生素對植物的分化和生長發(fā)育有一定的影響[3]，因此，通過篩選試驗(yàn)確定出最佳的抗生素使用范圍和臨界值，對從事遺傳轉(zhuǎn)化研究有重大的意義[4-5]。潮霉素、慶大霉素、羧芐霉素、頭孢霉素作為常用的抗性篩選標(biāo)記基因和抑菌劑被廣泛用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化工作。由于芍藥不同外植體的生長狀態(tài)和分化能力間存在差異，不同形態(tài)的外植體對不同抗生素的反應(yīng)不同，所以在轉(zhuǎn)化之前需對以上幾種抗生素的使用濃度進(jìn)行探討。

3.2 抗生素不同種類和濃度對不定芽分化的影響

適合的抗生素濃度是在不影響細(xì)胞正常生長的前提下，有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長[6]。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，通常導(dǎo)入的目的基因會對抗生素產(chǎn)生抗性，從而進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株，并將非轉(zhuǎn)化植株數(shù)量控制在最小范圍內(nèi)。本試驗(yàn)表明，潮霉素和慶大霉素對子葉和愈傷組織的分化均具有抑制作用，潮霉素的抑制作用更加顯著，更適宜作為選擇劑使用。潮霉素對不同外植體的分化作用也不盡相同，在同一濃度潮霉素下，子葉的不定芽分化率更高。所以選子葉作為外植體遺傳轉(zhuǎn)化受體更佳。

當(dāng)植物材料經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后，需及時用抗生素有效殺死并抑制農(nóng)桿菌生長，以防危害外植體的生長和分化，其中殺菌和抑菌效果最好的是頭孢霉素（Cef）和羧芐霉素（Carb）。然而抗生素對各種植物的組織分化影響不一[7-9]。因此，要測試植物對不同種類抗生素的敏感性，以確定抗生素篩選的臨界濃度，并選擇抑菌效果好、對植物組織再生影響較小的抗生素進(jìn)行除菌，這是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵之一。

本試驗(yàn)通過對芍藥愈傷組織和子葉2 種外植體在不同種類及濃度的抗生素中不定芽再生效率的研究，篩選了不同外植體各自的最佳抗生素和脫菌抗生素的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，芍藥愈傷組織和子葉對抗生素敏感，都可作為遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體。以子葉和愈傷組織2 種不同的受體分別建立了較為完整的芍藥遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，為進(jìn)一步進(jìn)行芍藥分子生物學(xué)轉(zhuǎn)基因方面的研究奠定了基礎(chǔ)，同時為芍藥基因克隆、分子鑒定等研究提供理論依據(jù)。