木蝴蝶的組培快繁技術(shù)研究

陳瑜珍，莫小路

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州 510520）

中藥木蝴蝶來源于紫葳科植物木蝴蝶[Oroxylum indicum（L.）Vent.]的干燥成熟種子，具有清肺利咽、疏肝和胃、斂瘡生肌等功效，常用于肺熱咳嗽、喉痹、音啞、肝胃氣痛等癥[1]。木蝴蝶種子外形呈扁圓形，中間有長條狀隔膜，邊緣具白色透明的膜質(zhì)翅，似白色蝴蝶，故名木蝴蝶；因其一個果莢內(nèi)有數(shù)百粒種子，層狀排列，似千層紙，故又名“千張紙”“千層紙”等[2]。在《全國中藥炮制規(guī)范》中，規(guī)定了木蝴蝶為“凈制”，即生品入藥，無需鹽水炒炙[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，中藥木蝴蝶提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)咳、降血糖及抗癌等作用[4-5]。木蝴蝶植物為落葉小喬木，其野生資源主要分布在我國福建、臺灣、廣東、廣西、四川、貴州及云南等地，在越南、老撾、泰國等東南亞國家也有分布，目前藥材主要來源于野生資源收集及進(jìn)口[6]。

由于木蝴蝶樹形和花果都具有較好的觀賞性，種子又可作藥用，其規(guī)?；N植前景可觀。國內(nèi)木蝴蝶種植主要采用播種育苗繁殖[7-9]，存在育苗周期長、出芽不整齊、有變異株型等問題。運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)種苗，具有繁殖效率高、出芽整齊、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前已在超過200 種藥用植物上取得了成功[10-11]，但木蝴蝶組織培養(yǎng)快繁育苗的研究尚未見報道。因此，本項(xiàng)目以木蝴蝶種子為試驗(yàn)材料進(jìn)行組培快繁技術(shù)研究，旨在建立木蝴蝶的組培快繁育苗技術(shù)體系，為木蝴蝶種苗的工廠化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

木蝴蝶種子購自藥店，經(jīng)國家中藥特色技術(shù)傳承人梁永樞鑒定為紫葳科植物木蝴蝶[Oroxylum indicum（L.）Vent.]的干燥成熟種子。

1.2 方法

1.2.1 種子篩選及預(yù)處理。從購買的種子中挑選膜衣外觀白色、無霉變、無蟲害、子葉飽滿無破損的種子，按子葉大小分為大（子葉面積≥15mm×10mm）、?。?mm×5mm ≤子葉面積＜15mm×10mm）2 組，2 組種子分別按下列2 種方法處理（大、小種子每個處理各50 粒種子）：A 是剝?nèi)シN子外層的膜質(zhì)種皮，只留子葉和胚；B 是將種皮外圍的膜衣剪去，保留種子周圍1～2 mm 寬的部分，不撕開膜衣（圖1）。

圖1 木蝴蝶種子及預(yù)處理

1.2.2 外植體消毒及初代培養(yǎng)。分別將A、B 方法處理的大、小種子進(jìn)行表面消毒，每組處理的種子分別用75%酒精消毒30s 后，再用有效氯為2%和5%的次氯酸鈉溶液消毒5～10min，用無菌水清洗4～5 次，無菌濾紙吸干種子表面水分，將種子接種于MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)種子萌發(fā)。

初代培養(yǎng)的容器為30mm×100mm 的平底試管，內(nèi)裝MS 培養(yǎng)基約5mL，每支試管接種1 粒種子。培養(yǎng)條件：25℃，弱光培養(yǎng)（1000Lux）,16h 光照/8h 黑暗。2周后，觀察、統(tǒng)計污染情況和種子萌發(fā)情況，計算污染率和萌發(fā)率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)。將沒有污染、已萌發(fā)露出新葉的芽苗取出試管，轉(zhuǎn)接至裝有MS 培養(yǎng)基的組培瓶內(nèi)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2500Lux，待苗高3cm 以上時，以此無菌苗的莖段和頂芽為外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

在超凈工作臺上，將無菌苗頂芽下的葉片切除，切下長約1cm 的頂芽，莖切割成0.5～1cm 的小段，每段帶1 個節(jié)，將頂芽和帶節(jié)莖段分別接種至含有不同濃度和配比的6-BA 和NAA 的MS 培養(yǎng)基上，每瓶接種外植體3～4 個。培養(yǎng)條件：25℃，16h 光照/8h 黑暗，光照強(qiáng)度2500Lux。30d 后統(tǒng)計芽分化的數(shù)量，計算增殖系數(shù)。

1.2.4 生根壯苗。增殖培養(yǎng)獲得的芽苗，經(jīng)分株培養(yǎng)至苗高3～4cm 時，轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。生根壯苗培養(yǎng)基為添加不同濃度NAA 和IBA 以及不添加生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS 培養(yǎng)基，考查生長素的類型和添加的濃度對木蝴蝶生根率、生根質(zhì)量的影響。培養(yǎng)條件與增殖培養(yǎng)相同（注：1/2 MS培養(yǎng)基為無機(jī)鹽含量減半的MS培養(yǎng)基，其他成分含量不變）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體及處理方法對木蝴蝶種子初代培養(yǎng)的影響

木蝴蝶種子采用不同消毒方法，經(jīng)初代培養(yǎng)后的結(jié)果顯示：體積大的種子萌發(fā)率高于體積小的；在大種子中，采用B 方法處理（即保留種子周圍1～2mm 寬的膜衣不撕開）的種子，在2%次氯酸鈉消毒10min 和5%次氯酸鈉消毒5min 的2 種條件下，其萌發(fā)率都高于A 方法（剝?nèi)シN子外層膜衣）；而采用5%次氯酸鈉消毒5min 的方法，無論是大、小種子，其污染率都很低，僅為4%。

采用A 方法處理的大、小種子，其污染率都較低，其中，用5%次氯酸鈉消毒5min 的效果優(yōu)于用2%次氯酸鈉消毒10min 的，但A 方法處理的種子萌發(fā)率都低于B 方法處理的。（表1），其中，用75%酒精消毒30s，再用2%次氯酸鈉消毒10min 的種子萌發(fā)率最高（80%）。

表1 不同外植體及處理方法對木蝴蝶種子初代培養(yǎng)的影響

2.2 培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑對外植體增殖培養(yǎng)的影響

以木蝴蝶無菌苗的莖段、頂芽為外植體，分別接種到含不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，木蝴蝶莖外植體類型、培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)種類和濃度都對芽生成有影響。頂芽外植體在各組培養(yǎng)基上均未生成叢生芽，只有少數(shù)在基部有1～2 個芽，大部分只有頂芽生長；帶節(jié)莖段外植體在（1）（2）（5）組培養(yǎng)基上，每個外植體出芽數(shù)量在1～3 個，而在添加1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基上，莖段外植體基部先形成愈傷組織，愈傷組織較緊密，30d后陸續(xù)分化出芽（圖2 h,i），單個外植體出芽數(shù)最高為16 個，平均每個外植體的出芽數(shù)（增殖系數(shù)）為8.24（表2）。

圖2 木蝴蝶組培快繁過程

表2 培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑對莖段、莖尖外植體叢生芽形成的影響

2.3 生根壯苗培養(yǎng)

將增殖后的無根芽苗轉(zhuǎn)入各組生根培養(yǎng)基，每組10 瓶，每瓶接種3 株，培養(yǎng)30d 后統(tǒng)計生根結(jié)果見表3。在無機(jī)鹽減半的1/2MS 培養(yǎng)基上，不添加任何生長激素，木蝴蝶的生根率只有36.7%，而在1/2 MS 培養(yǎng)基中添加NAA（濃度0.1～0.3mg/L）或IBA（濃度0.5～1.5 mg/L）都能顯著提高木蝴蝶的生根率，其中，添加0.5 mg/L IBA 的生根率最高，為93.3%；在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，IBA 對木蝴蝶單株生根的數(shù)量以及根長的作用都優(yōu)于NAA，但添加NAA 能較早啟動根的分化，在培養(yǎng)基（3）和（4）中的苗約在接種后15d 開始有根萌出，而培養(yǎng)基（1）和（5）（6）（7）中的無根苗在21d 后才開始生出；并且在（2）（3）（4）培養(yǎng)基上長出的根都粗壯，而（5）（6）（7）培養(yǎng)基上生的根較細(xì)長。綜合生根率、生根質(zhì)量，篩選（5）培養(yǎng)基為最佳生根壯苗培養(yǎng)基，即1/2 MS 培養(yǎng)基+0.5 mg/L IBA。

表3 生長調(diào)節(jié)劑對木蝴蝶生根的影響

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中，外植體的消毒是初代培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，本試驗(yàn)采用含氯消毒劑次氯酸鈉對木蝴蝶種子進(jìn)行表面消毒。結(jié)果表明，選擇2%有效氯的次氯酸鈉對帶少量外膜的種子消毒10min，可以達(dá)到較好消毒效果，并且種子萌發(fā)率最高，達(dá)80%。去掉種子外層膜衣雖然可以提高消毒效果，降低污染率（低于12%），但由于種胚直接暴露在消毒液中會有損傷，加上剝外膜所造成的機(jī)械性損傷，都會影響種子的活力，種子萌發(fā)率很低。

利用種子萌發(fā)獲得的無菌苗莖段外植體，在附加1.0mg/L BA+0.2mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)約20d，外植體基部形成大量愈傷組織，隨后愈傷組織分化出芽，單個外植體的增殖系數(shù)達(dá)到8.24。生根誘導(dǎo)試驗(yàn)中，木蝴蝶無根苗在無機(jī)鹽減半但沒有添加生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中生根率較低（36.7%），而添加NAA 和IBA 對木蝴蝶生根有明顯促進(jìn)作用，但二者對木蝴蝶根形態(tài)發(fā)生的作用效果不同，其中，添加NAA 啟動根萌發(fā)的時間較快，而IBA 的作用稍遲；并且在添加NAA 的培養(yǎng)基中，木蝴蝶形成的根較粗、短，根的數(shù)量較少；而添加IBA 的培養(yǎng)基中，木蝴蝶形成的根細(xì)、長而密，根系發(fā)達(dá)，這與文獻(xiàn)[5]報道的IBA 作用相似；但I(xiàn)BA 對木蝴蝶單株生根數(shù)量并沒有隨作用濃度的提高而提高，其原因還有待于進(jìn)一步探索。

本研究利用木蝴蝶種子無菌萌發(fā)獲得的無菌苗，將無菌苗帶節(jié)莖段在附加1.0mg/L BA 和0.2mg/L NAA的MS 培養(yǎng)基上獲得大量芽苗增殖，將增殖后的無根芽苗轉(zhuǎn)移至附加0.5mg/L IBA 的1/2 MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，生根率可達(dá)93.3%，建立了木蝴蝶高效植株再生體系，該木蝴蝶種苗快繁技術(shù)通過后續(xù)的煉苗移栽，可實(shí)現(xiàn)木蝴蝶組培苗的工廠化生產(chǎn)，為木蝴蝶種植產(chǎn)業(yè)提供充足種苗。