甜瓜紅心脆和早皇后再生體系的建立

王愛玲　張敏　鄭賀云等

摘要：為了初步篩選出適宜誘導(dǎo)甜瓜紅心脆、早皇后子葉和下胚軸愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基，以及篩選適宜其不定芽伸長(zhǎng)和生根的培養(yǎng)基，采用組織培養(yǎng)的方法，以甜瓜紅心脆和早皇后種子為材料、子葉和下胚軸為外植體，進(jìn)行添加不同濃度6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）激素組合的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽、不定芽伸長(zhǎng)、芽生根的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，MS+0.5 mg/L IAA、MS+1.0 mg/L IAA 培養(yǎng)基不利于紅心脆子葉愈傷組織的誘導(dǎo)，其余培養(yǎng)基均有利于其子葉和下胚軸愈傷組織的形成；MS和MS+0.3 mg/L IAA培養(yǎng)基不利于早皇后子葉愈傷組織的形成，MS培養(yǎng)基不利于其下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，其余培養(yǎng)基均有利于其愈傷組織的形成；適宜誘導(dǎo)紅心脆子葉不定芽的培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，適宜誘導(dǎo)早皇后子葉不定芽培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA；適宜誘導(dǎo)紅心脆、早皇后下胚軸不定芽的培養(yǎng)基分別為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA、MS+0.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA；MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L IAA培養(yǎng)基分別適宜紅心脆、早皇后不定芽伸長(zhǎng)；2個(gè)品種適宜的生根培養(yǎng)基均是1/2MS+1.0 mg/L IBA。研究初步建立了甜瓜紅心脆、早皇后的再生體系，為其遺傳轉(zhuǎn)化研究作了準(zhǔn)備。

關(guān)鍵詞：甜瓜；子葉；下胚軸；不定芽；生根；愈傷組織誘導(dǎo)；適宜培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)： S652.04+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0082-03

收稿日期：2014-10-28

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：KY2012080）。

作者簡(jiǎn)介：王愛玲（1983—），女，山西運(yùn)城人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事甜瓜育種的研究。E-mail：ailing210@126.com。紅心脆甜瓜，原名阿依思汗可口奇，原產(chǎn)于鄯善縣魯克沁，主要分布于新疆吐魯番盆地，全疆各地也有栽培。紅心脆甜瓜植株生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，較耐貯藏運(yùn)輸，抗病性較差，品種品質(zhì)較佳，目前是新疆地區(qū)的主要出口品種之一。甜瓜早皇后是從新蜜1號(hào)和新疆地方品種黃皮瓜中選出的自交系配制而成的厚皮甜瓜一代雜種，全生育期84 d，果實(shí)發(fā)育期38～40 d，生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，果實(shí)橢圓形，果皮金黃色，網(wǎng)紋細(xì)密，果形整齊，果肉橘紅色，肉質(zhì)松脆、爽口，風(fēng)味好，耐運(yùn)輸，抗病性優(yōu)于早皇后[1]。上述甜瓜優(yōu)良的商品性狀一直受到人們的青睞，也已成為甜瓜育種者的研究目標(biāo)之一。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，使得增加甜瓜的優(yōu)良性狀成為可能。建立甜瓜再生體系的研究報(bào)道很多，但幾乎都缺乏可重復(fù)性，沒有一套完整的可重復(fù)的建立再生體系的培養(yǎng)基[2-3]。本研究的目的就是通過建立甜瓜紅心脆、早皇后再生體系，為以后提高其再生率作初步研究，進(jìn)而為提高遺傳轉(zhuǎn)化率、獲得轉(zhuǎn)基因植株作準(zhǔn)備。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紅心脆、早皇后甜瓜種子，由新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無(wú)菌材料的獲得種子去殼后，在無(wú)菌條件下分別用75%乙醇處理1 min、15%NaClO處理30 min，再用無(wú)菌水沖洗3～4次，然后接種到MS培養(yǎng)基上（含蔗糖30 g/L、瓊脂6.5 g/L、pH值6.0），放置于24～28 ℃下培養(yǎng)，每天光照9～10 h，光照度為1 500～2 000 lx[4]。

1.2.2愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)將生長(zhǎng)5 d無(wú)菌苗在無(wú)菌條件下切成4 mm×4 mm的子葉和長(zhǎng)度為5 mm的下胚軸作為外植體，分別接種至表1的25種培養(yǎng)基上，6-BA、IAA激素濃度單位為 mg/L，下同。每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶5個(gè)外植體。30 d后統(tǒng)計(jì)甜瓜紅心脆、早皇后子葉、下胚軸的出愈率、出芽率，觀察外植體接種后的形態(tài)變化并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.3不定芽伸長(zhǎng)的誘導(dǎo)將長(zhǎng)出的不定芽接種至表2的9種培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接3瓶，每瓶接種4個(gè)不定芽，之后統(tǒng)計(jì)甜瓜紅心脆、早皇后不定芽的伸長(zhǎng)率，觀察其伸長(zhǎng)情況并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4生根將不定芽伸長(zhǎng)的植株，接種至配方為1/2MS+1.0 mg/L IBA、1/2MS+2.0 mg/L IBA的2種生根培養(yǎng)基上，觀察其生根情況[5-6]。

1.2.5數(shù)據(jù)分析用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)紅心脆、早皇后子葉愈傷組織和不定芽的情況

從表3看出，除23、24號(hào)培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基均有利于紅心脆子葉愈傷組織的誘導(dǎo)，10、14號(hào)培養(yǎng)基有利于其不定芽的生長(zhǎng)，出芽率可達(dá)到8%；除1、22號(hào)培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基均有利于早皇后子葉愈傷組織的誘導(dǎo)，18號(hào)培養(yǎng)基有利于其不定芽的生長(zhǎng)，出芽率可達(dá)到12%。可見，除MS+0.5 mg/L IAA、MS+1.0 mg/L IAA培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基均有利于誘導(dǎo)紅心脆子葉愈傷組織的形成，適宜其不定芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基均有利于早皇后子葉愈傷組織的誘導(dǎo)，最適宜其不定芽生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA。

2.2誘導(dǎo)紅心脆、早皇后下胚軸愈傷組織和不定芽的情況

從表4可看出，25種培養(yǎng)基均有利于紅心脆下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，13號(hào)培養(yǎng)基有利于其不定芽的生長(zhǎng)，出芽率可達(dá)到8%；除1號(hào)培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基均有利于早皇后下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，4號(hào)培養(yǎng)基有利于其不定芽的生長(zhǎng)，出芽率可達(dá)到20%?？梢?5種培養(yǎng)基均有利于誘導(dǎo)紅心脆下胚軸愈傷組織的形成，最適宜其不定芽生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA；除MS培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基均有利于早皇后下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，最適宜其不定芽生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是MS+0.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA。

2.3紅心脆、早皇后的不定芽伸長(zhǎng)情況

脆不定芽伸長(zhǎng)，其不定芽伸長(zhǎng)率為75%；最適宜早皇后不定芽伸長(zhǎng)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L IAA，其不定芽伸長(zhǎng)率為 37.5%。

2.4紅心脆、早皇后生根情況

1/2MS+1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基均適宜紅心脆、早皇后生根，根粗壯且分支多，芽繁殖數(shù)較高（表6）。

2.5甜瓜子葉和下胚軸再生體系初步建立的全過程

選擇甜瓜子葉和下胚軸再生體系建立過程中的典型特征組合，詳見圖1。

3討論與結(jié)論

選擇不同基因型的甜瓜品種，以不同的組織作外植體，適宜的培養(yǎng)基也不同?；蛐蛯?duì)不定芽發(fā)生和植株再生體系的建立具有決定性的作用[7]，國(guó)內(nèi)外對(duì)甜瓜再生體系的研究很多，但都不能建立起一套通用的甜瓜再生體系。研究者們都采用不同的甜瓜品種和不同組織材料，篩選出的最適宜培養(yǎng)基也不同。陶興林等以6個(gè)厚皮甜瓜品種的子葉為外植體材料，發(fā)現(xiàn)其再生能力各不相同[2]。陶興林等用綠寶石、甘甜一號(hào)甜瓜為材料，研究了6-BA、IAA激素濃度組合培養(yǎng)基對(duì)5 d苗齡的子葉愈傷組織和不定芽的分化情況，結(jié)果表明，綠寶石的最適宜不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有2.0 mg/L 6-BA的，甘甜一號(hào)品種的最適宜不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有1.0、2.0 mg/L 6-BA的[8]。喬永旭用甜瓜鑫福999的5 d苗齡的子葉、下胚軸、真葉作為材料，研究6-BA、IAA、2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)其愈傷組織、不定芽、不定芽伸長(zhǎng)和生根的影響，結(jié)果表明：適宜愈傷組織誘導(dǎo)的材料為子葉，MS+0.5 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA是最適宜愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基[9]。子葉是適宜誘導(dǎo)不定芽的外植體，MS+1.0 mg/L 6-BA為適宜不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基為適宜其生根的培養(yǎng)基。這些均與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致，都認(rèn)為不同基因型的甜瓜品種，以不同的組織作外植體，適宜的培養(yǎng)基各不相同。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅心脆和早皇后，取各自的子葉、下胚軸作外植體，適宜的培養(yǎng)基各不相同。

植物生長(zhǎng)素與分裂素的種類對(duì)不同植物的敏感差異很大，因此激素種類的選擇應(yīng)根據(jù)植物種類的不同而異。由于甜瓜本身的內(nèi)源生長(zhǎng)素含量比較高，所以也需要根據(jù)不同的目的調(diào)整植物生長(zhǎng)素與分裂素的比值[10]。6-BA是甜瓜再生分化的關(guān)鍵物質(zhì)[11-15]。馬國(guó)斌等認(rèn)為，甜瓜組織培養(yǎng)的適宜外植體是未成熟子葉、幼苗子葉和真葉，甜瓜未成熟子葉和幼苗子葉不定芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基是改良的Miller+3 mg/L ZT+0.1 mg/L IAA[16]，本試驗(yàn)研究也認(rèn)同上述觀點(diǎn)。

本研究以紅心脆、早皇后的子葉和下胚軸作外植體，初步建立一套完整的再生體系。結(jié)果表明，MS+0.5 mg/L IAA、MS+1.0 mg/L IAA培養(yǎng)基不利于紅心脆子葉愈傷組織的誘導(dǎo)，其余培養(yǎng)基均有利于其子葉和下胚軸愈傷組織的形成；MS和MS+0.3 mg/L IAA培養(yǎng)基不利于早皇后子葉愈傷組織的形成，MS培養(yǎng)基不利于其下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，其余培養(yǎng)基均有利于其愈傷組織的形成；適宜誘導(dǎo)紅心脆子葉不定芽的培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，最適宜早皇后子葉不定芽培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA；適宜誘導(dǎo)紅心脆、早皇后下胚軸不定芽的培養(yǎng)基分別為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3mg/LIAA、MS+0.3mg/L6-BA+0.5 mg/L IAA；MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L IAA培

養(yǎng)基分別適宜紅心脆、早皇后不定芽伸長(zhǎng)；生根培養(yǎng)基均是1/2MS+1.0 mg/L IBA。

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