AHP-CRITIC法結合正交設計優(yōu)選復方丹參方中丹參與三七的水提工藝

雷芳，伍丹情，費清松，羅芮，何寧，2，3，4*（.安徽中醫(yī)藥大學藥學院藥劑系，合肥 23002；2.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，合肥 23002；3.安徽省中醫(yī)藥科學院藥物制劑研究所，合肥 23002；4.現代藥物制劑安徽省工程技術研究中心，合肥 23002）

復方丹參方是上海中藥二廠于1977年研制成功并投產的經典名方，由丹參、三七和冰片三味中藥組成，具有活血通絡、理氣止痛的功效，臨床可用于治療心腦血管相關疾病。目前，復方丹參方已有六種劑型收載于2020年版《中國藥典》，復方丹參滴丸更是全球首例完成美國FDAⅢ期臨床研究（NCT01659580）的中藥復方制劑，臨床治療心絞痛、冠心病有很好的療效。除了劑型和丹參量的不同，制劑過程中丹參、三七提取工藝造成的活性組分差異性也會影響療效。丹參水溶性成分的藥效遠高于其脂溶性成分，近年來丹參水溶性成分治療心血管疾病的潛力被慢慢發(fā)掘，臣藥三七與之合煎時有助于丹參成分溶出和含量穩(wěn)定，因此研究復方丹參方中丹參和三七合提時的水提工藝是十分有意義的。

復方丹參方的藥效物質基礎為親脂性二萜類、親水性酚酸類及三七皂苷三大類化合物。丹參素是丹參中一種水溶性酚酸，具有改善血液流變學、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等藥理作用，屬于冠心病治療的關鍵藥性成分，同時也是藥典中復方丹參滴丸的含量測定成分。三七皂苷是三七的質量控制指標成分，藥理學研究表明三七皂苷具有降低耗氧、擴張血管、抑制血小板聚集等作用。本文建立UHPLC 含量測定方法，同時測定丹參素鈉、人參皂苷Rg，并在預試驗中發(fā)現三七皂苷中人參皂苷 Rg1 在大鼠血漿和組織中含量較高，考慮到后期大鼠體內研究，最終選擇人參皂苷Rg作為提取工藝評價指標之一。

中藥材煎煮后的藥液若不經醇沉、水沉等處理會含有多糖、淀粉、鞣質等雜質，不能進行注射或眼用，除雜過程也伴隨著有效成分的損失。本課題組前期工作已證實藥物經眼全身遞送的可行性，且冰片因其易揮發(fā)的性質一般在藥材提取完成后加入，因此本文以丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量為評價指標，使用AHPCRITIC 法確定權重系數，參考復方丹參滴丸的制備工藝，正交設計優(yōu)選出復方丹參方中丹參與三七的水提工藝，并考察水煎液在醇沉調堿和水沉調酸過程中pH 對評價指標的影響，為后期復方丹參方的眼用制劑研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate3000 戴安超高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；旋轉蒸發(fā)儀、SHK-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科泰實驗設備有限公司）；HH-501 超熱恒溫水?。ń饓芯Р嶒瀮x器廠）；DHG-9640AB 電熱鼓風干燥箱（常州普天儀器制造有限公司）；PHS-3C 型pH 計（上海三信儀表廠）。

1.2 試藥

丹參（批號：DS21-01）、三七（批號：SQ21-01）（安徽華貅藥業(yè)有限公司）；丹參素鈉對照品（批號：PS000270，純度≥98%）、人參皂苷Rg對照品（批號：DST180323-009，純度≥98%）（成都德思特生物技術有限公司）；95%乙醇、氫氧化納、鹽酸、磷酸（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水，甲醇和乙腈均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 丹參素鈉和人參皂苷Rg1 的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Accucore C（100 mm×4.6 mm，2.6 μm），流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脫，見表1，流速：0.3 mL·min，檢測波長：280 nm（丹參素鈉）、203 nm（人參皂苷Rg），柱溫：30℃，進樣量：1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

時間/min乙腈（A）/%0.2%磷酸水（B）/%0 1090 6 1090 8 2179 112575 183367 284060

2.1.2 溶液的制備 精密稱取丹參素鈉、人參皂苷Rg對照品各10 mg，分別置于5 mL 棕色量瓶中，加70%甲醇制備成質量濃度為2 mg·mL的儲備液，備用。分別精密吸取丹參素鈉、人參皂苷Rg儲備液適量，加70%甲醇稀釋成每1 mL 分別含1 mg 丹參素鈉、1 mg 人參皂苷Rg的混合對照品溶液。

精密稱取45 g 丹參、8.8 g 三七于砂鍋中，加入10 倍量超純水，浸泡45 min 后煎煮2.5 h，煎液經紗布趁熱過濾，離心后取上清液濃縮至50 mL，加適量乙醇至含醇量為75%，靜置一夜，過濾，回收乙醇，濃縮并定容至50 mL 量瓶中；精密吸取適量復方丹參提取液，加70%甲醇稀釋20倍，3000 r·min渦旋3 min，15 000 r·min離心10 min，離心兩次，取上清液，即得。

分別按上述供試品溶液的制備方法制備缺丹參、缺三七的陰性樣品溶液。

2.1.3 線性關系的考察 分別取“2.1.2”項下混合對照品溶液0.125、0.25、0.5、1、2、3 mL 置于5 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，按“2.1.1”項下色譜條件測定并繪制標準曲線。結果丹參素鈉、人參皂苷Rg的線性回歸方程分別為

y

＝0.0297

x

＋0.0933、

y

＝0.012

x

－0.0231，

R

均為0.9999。表明丹參素鈉和人參皂苷Rg在25 ～600 μg·mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4 專屬性考察 取“2.1.2”項下各溶液進樣1 μL 進行測定，結果見圖1，待測組分與相鄰峰的分離度均大于1.5，且各峰之間并無干擾，該方法的專屬性良好。

圖1 供試品（a）、對照品（b）、陰性供試品（c）的UPLC 色譜圖Fig 1 UHPLC chromatograms of sample（a），reference（b），negative（c）

2.1.5 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液適量，連續(xù)測定6 次，記錄峰面積。丹參素鈉峰面積的

RSD

為1.1%，人參皂苷Rg峰面積的

RSD

為0.29%，表明儀器的精密度較好。2.1.6 重復性考察 取適量復方丹參供試品溶液，平行制備6 份，進樣測定，結果丹參素鈉和人參皂苷Rg含量的

RSD

分別為1.6%、1.9%，均小于2%，表明方法重復性良好。2.1.7 樣品溶液穩(wěn)定性考察 取同一批復方丹參供試品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24 h 進樣，結果丹參素鈉、人參皂苷Rg峰面積的

RSD

分別為0.50%、0.38%（

n

＝6），表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。2.1.8 加樣回收率考察 精密吸取適量供試品溶液（丹參素鈉、人參皂苷Rg含量分別為73.70 μg、57.85 μg）于5 mL 量瓶中，共6 份，每份精密加入適量混合對照品溶液（丹參素鈉、人參皂苷Rg含量分別為78.13 μg、56.53 μg），70%甲醇定容至刻度，進樣測定，測得丹參素鈉、人參皂苷Rg的平均加樣回收率分別為101.41%、98.67%，

RSD

分別為1.3%、0.53%，表明方法回收率良好。

2.2 總固體含量測定

精密吸取10 mL 提取液于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h，冷卻并稱定重量，計算總固體含量。

2.3 單因素實驗

本實驗以丹參素鈉、人參皂苷Rg的含量為考察指標，結合相關文獻考察了粒徑、加水量、浸泡時間、提取時間、提取次數對復方丹參方水提工藝的影響。粒徑考察中發(fā)現丹參、三七藥材經打粉機粉碎后大多能通過七號篩，由于飲片整體硬度不一致，通過二、三號篩的基本為外表皮部或韌皮部，而木栓部能通過九號篩，這說明藥材過篩后存在部位差異性，無法保持單一變量進行單因素實驗。浸泡時間的結果發(fā)現浸泡45 min后藥材的提取效果最好，故藥材煎煮前統(tǒng)一浸泡45 min。而對加水量、提取時間、提取次數的考察發(fā)現隨著因變量的增大，有效成分的含量也隨之增大，單因素實驗結果見圖2。

圖2 單因素實驗結果Fig 2 Single factor experiment

2.4 正交實驗設計

根據前期單因素實驗結果確定了考察因素，并以丹參素鈉、人參皂苷Rg及總固體含量為考察指標，用L（3）正交設計表進行實驗。因素水平見表2。

表2 因素水平表
Tab 2 Factor and level

水平因素加水量/A提取次數/B提取時間/C 1 8 1 1.5 2 1022.0 3 1232.5

2.5 指標權重的確立

2.5.1 層次分析法（AHP）法AHP 是將決策者的經驗判斷予以量化的主觀權重賦權法。本文以丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量作為權重指標予以量化，依據丹參、三七君臣配伍原則，指標優(yōu)先順序為丹參素鈉含量＞人參皂苷Rg含量＞總固體含量，采用1 ～9 標度法評判兩兩指標之間的重要性并構造成對比較矩陣A，見表3。按式（1）計算矩陣A 中每一行元素乘積的

n

次方根

β

，對

β

＝（

β

，

β

，…，

β

）歸一化后得到特征向量W ＝（W，W，…，W），即（0.7306，0.1884，0.0810）。

表3 指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣
Tab 3 Priority judgment matrices for pairwise comparison of indicators

權重指標含量（mg·g－1）丹參素鈉人參皂苷Rg1總固體丹參素鈉含量157人參皂苷Rg1 含量 1/513總固體含量 1/7 1/31

根據式（2）計算出矩陣最大特征值

λ

為3.0649，（AW）表示向量AW 的第

i

個元素，最后通過公式C.I.＝（

λ

－

n

）/（

n

－1）和C.R.＝C.I./R.I.計算出一致性檢驗指標（C.R.）＝0.0624 ＜0.10，即構造的成對比較矩陣具有滿意的一致性，權重系數分別為0.7306、0.1884、0.0810。2.5.2 CRITIC 法CRITIC 法是完全依據數據本身的客觀屬性而科學評價的的客觀賦權法。首先對表4 中的原始數據進行無量綱化處理[指標成分值＝（實測值－最小值）/（最大值－最小值）]，經MATLAB 處理后得到相關系數矩陣B和各指標對比強度（

S

），再通過下列公式計算出沖突性（

R

）、信息量（

C

）與權重（

W

），結果見表5。

表4 正交實驗設計及結果
Tab 4 Design and result of orthogonal experimental

No.A B CD（誤差）含量（mg·g－1）綜合評分丹參素鈉 人參皂苷Rg1 總固體111111.93884.36390.1918 47.93 212223.44624.90680.2398 74.97 313334.55345.41710.2593 94.89 421232.37603.93250.2178 54.24 522313.99084.85160.2392 83.68 623124.06457.07600.2698 92.02 731323.00804.21000.2212 65.43 832133.41725.85700.2546 77.58 933213.79256.14180.2608 84.66

表5 CRITIC 法相關計算數據(mg·g)
Tab 5 CRITIC method related calculation data (mg·g)

－1考察指標丹參素鈉Sj0.3204 Rj0.4423含量（mg·g）人參皂苷Rg1總固體0.32550.3228 0.47740.2513 Cj0.14170.15540.0811 Wj0.37470.41090.2144

（注：

r

表示評價指標

i

和

j

之間的相關系數）

由表5 可知，CRITIC 法計算出的丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量的權重系數分別為0.3747、0.4109、0.2144。

2.5.3 AHP-CRITIC 法AHP-CRITIC 法是由AHP 法和 CRITIC 法混合加權得到的方法，計算公式為

W

＝（WAHP×WCRITIC）/∑（WAHP×WCRITIC），

i

為第

i

個因素；

j

為第

j

個樣本。AHP-CRITIC 混合加權法計算出的丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量綜合權重系數分別為0.7428、0.2101、0.0471。2.5.4 綜合評分比較通過上述3 種計算方法得到相應的3 組權重系數，綜合評分后的結果見表6。綜合評分＝[（丹參素鈉含量/丹參素鈉最大含量）×0.7428 ＋（人參皂苷Rg含量/人參皂苷Rg最大含量）×0.2101 ＋（總固體含量/總固體最大含量）×0.0471]×100。采用MATLAB 軟件對3 種計算方法進行相關系數分析。AHP 法與AHP-CRITIC 法的相關系數為1.000，CRITIC 法與AHP-CRITIC 法的相關系數為0.9715，AHP 法與CRITIC 法的相關系數為0.9703，3 組均有顯著相關性（

P

＜0.01），說明3 種計算方法具有一致性的評分結果。AHP 法與 CRITIC法權重系數的相關系數為0.4834，相關性不顯著（

P

＝0.6788），說明兩者反映的信息不具有疊加性。因此采用AHP-CRITIC 法計算綜合評分。

表6 3 種賦權法的綜合評分
Tab 6 Comprehensive scores of three empowerment methods

?試驗號AHPCRITICAHP-CRITIC 1 48.4956.5447.93 2 75.5675.9174.97 3 95.2789.5394.89 4 55.1359.7054.24 5 84.1380.0283.68 6 92.1695.9892.02 7 66.1166.7865.43 8 78.0782.3677.58 9 85.0387.6084.66

2.6 正交實驗

對AHP-CRITIC 法計算的綜合評分進行分析，直觀分析結果見表7，方差分析結果見表8。

表7 直觀分析結果
Tab 7 Intuitive analysis

因素ABCD（誤差）k172.59755.86772.51072.090 k276.64778.74371.29077.473 k375.89090.52381.33375.570 R 4.05034.65610.043 5.383

表8 方差分析結果
Tab 8 Results of variance analysis

方差來源 偏差平方和 自由度FF 臨界值 顯著性A 27.8212 0.7676.940＞0.05 1863.195251.3746.940＜0.05 C 180.2082 4.9696.940＞0.05 D（誤差）72.532－－－B

由表7 可知各因素對實驗結果影響的大小，即提取次數（B）＞提取時間（C）＞加水量（A），直觀分析最佳工藝為ABC。方差分析結果顯示提取次數對綜合評分影響顯著（

P

＜0.05），加水量和提取時間對其無顯著性影響，綜合直觀分析、方差分析結果并考慮到后期實驗安排，最終確定提取工藝為ABC，即10倍水煎煮2.5 h，共提取3 次。

2.7 驗證優(yōu)化工藝

按處方量稱取適量丹參、三七，按照最佳工藝ABC進行實驗驗證，重復3 次，結果見表9。結果表示在最佳提取工藝下，丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體平均含量分別為6.0995、3.9546、0.2648 mg·g，

RSD

分別為0.95%、0.33%、1.6%，即正交設計優(yōu)選出的最佳工藝是可行的。

表9 工藝驗證實驗(mg·g)
Tab 9 Process verification test (mg·g)

實驗次數丹參素鈉人參皂苷Rg1總固體1 6.04503.94360.2630 2 6.09283.95130.2695 3 6.16083.96890.2619平均值6.09953.95460.2648 RSD/%0.950.331.6

2.8 丹參、三七醇沉調堿、水沉調酸的pH 條件優(yōu)化

中藥滴眼液應按照中藥注射液的制備方法來制備，參考丹參注射液標準制備工藝中醇沉調堿至pH 為8 ～9，水沉調酸至pH 為2 ～3。本文研究調堿至pH ＝8.0、8.5、9.0，調酸至pH ＝2.0、2.5、3.0 時丹參素鈉、人參皂苷Rg和總固體含量的變化，實驗均在室溫（25 ℃）下進行，重復3 次，結果見表10。

由表10 可知pH 為8.0 時，丹參素鈉、人參皂苷Rg收率均＞100%，這可能是溶液中其他成分在此pH 下轉化而來，pH 從8.5 到9.0 變化時，丹參素鈉、人參皂苷Rg收率均略微升高，但總固體除去率有所降低，因此綜合考慮水煎液醇沉調堿可至8.0 ～8.5。當pH 在2.0 ～3.0 變化時丹參素鈉收率和總固體除去率先升高后降低，但人參皂苷Rg收率一直在升高，pH ＝3.0時收率為92.48%，綜上考慮水煎液水沉調酸可至2.5 ～3.0。

表10 各種pH 下醇沉、水沉的結果(%)
Tab 10 Alcohol precipitation and water precipitation under various pH values (%)

pH丹參素鈉收率人參皂苷Rg1 收率總固體除去率8.0107.93111.9022.41 8.5 91.97 96.3327.04 9.0 92.81 98.9325.28 2.0 96.88 68.40 8.06 2.5100.24 79.70 9.15 3.0 97.07 92.48 7.22

3 討論

丹參-三七是常用的活血化瘀藥對，兩者功效相近，配伍后功效倍增，研究表明兩者合煎后能產生新的化合物，這也意味著兩者配伍并不是簡單的兩藥加和。目前，復方丹參方相關劑型中只有滴丸劑是由丹參、三七加水合煎制成，其他劑型均由丹參經醇提、水提分步提取后與三七細粉或其醇提物混勻制成，本文考察丹參、三七合煎時的水提工藝旨在為后期開發(fā)復方丹參方相關劑型提供基礎。

中藥復方中多指標權重系數的確定十分重要，過去考慮到復方多具有“君臣佐使”的組方原則，大多會根據經驗確定權重系數，多有主觀性，卻忽略了客觀數據信息的影響。本文采用了AHP-CRITIC 法計算綜合評分，可兼顧主客觀因素，得到的結果也更合理，更科學。

前期對水提方法和單因素實驗考察發(fā)現丹參素對提取溫度和時間要求較高，本文優(yōu)選出的最佳水提工藝也證明了這一點，這是因為丹參有效成分中含量最高的丹酚酸B 會在高溫下慢慢降解產生丹參素。而在實際生產中，考慮到耗能和成本問題，應從藥材源頭開始把控，確定最佳提取pH 值、合理藥材二煎或三煎時間等，優(yōu)選出適合實際生產的最佳工藝。