基于細(xì)胞凋亡芯片的白花敗醬草乙酸乙酯部位抗結(jié)腸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)研究

丁昕瑤，王帥，李天嬌，趙琳，包永睿，孟憲生（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

白花敗醬，來源于敗醬科敗醬屬，其名首載于春秋時(shí)期的《范子計(jì)然》。白花敗醬草味辛、苦，性微寒，具有清熱解毒、活血化瘀之功，可用于治療腸癰、燥熱便秘、產(chǎn)后瘀血等癥。臨床上常用于潰瘍性結(jié)腸炎、慢性胃炎、腫瘤等疾病。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研及前期體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，白花敗醬草乙酸乙酯部位對(duì)結(jié)腸癌具有較好的抑制作用，但其化學(xué)成分與藥效間關(guān)系并未得到合理解釋。

微流控芯片是由微米級(jí)尺寸的微通道組成的芯片。它將傳統(tǒng)化學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能集成到一起，與常規(guī)96 孔板相比，微流控芯片細(xì)胞培養(yǎng)法能更好地模擬細(xì)胞在人體內(nèi)的生存環(huán)境。微流控芯片技術(shù)用于體外藥效評(píng)價(jià)具有高靈敏度、快速簡便、消耗低等優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)將微流控芯片技術(shù)與熒光技術(shù)相結(jié)合，通過灰色關(guān)聯(lián)度及偏最小二乘回歸分析法分析白花敗醬草譜效關(guān)系，篩選出白花敗醬草抗結(jié)腸癌的活性成分，為復(fù)雜體系的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究方法提供研究思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞[齊氏（上海）生物科技有限公司]。

1.2 試藥

10 批白花敗醬草樣品采自不同省市，詳細(xì)信息見表1，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為

Patriniavllosa

的干燥全草。 槲皮素（批號(hào)：111595-201604）、 咖啡酸（批號(hào)：111915-201608）、綠原酸（批號(hào)：110715-201620）、阿魏酸（批號(hào)：111595-200301）、蘆?。ㄅ?hào)：111701-200503）、槲皮苷（批號(hào)：110715-201620）、橙皮苷（批號(hào)：1521-200204）、木犀草素（批號(hào)：111701-200607）（對(duì)照品，純度≥99%，中國食品藥品檢定研究院）；質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈（德國Merck 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲酸（色譜純，美國Thermo 公司，批號(hào)：141831A）；乙酸乙酯（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；Hoechst33342/PI 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；胎牛血清、胰蛋白酶（美國GIBCO 公司）；L-15 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200910）；青霉素/鏈霉素溶液（Meilunbio 公司）；負(fù)性環(huán)氧樹脂光刻膠SU-8 及顯影液（美國Micro-Chem 公司）；Sylgard 184 型聚二甲基硅氧烷PDMS 及固化劑（美國Dow-Corning 公司）。

表1 10 批白花敗醬草樣品來源信息
Tab 1 Source information of 10 batches of

編號(hào)批號(hào)產(chǎn)地編號(hào)批號(hào)產(chǎn)地S120190828廣西S620190519四川S220190817江蘇S720200521內(nèi)蒙S320200305湖北S820200722河南S420200416安徽S920200910江西S520200523河北S1020200729山東

1.3 儀器

LSP04-1A 型精密注射泵（保定蘭格公司）；NIKON ECLIPSE TI 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；TG-2U 型光刻機(jī)（北京中科同志科技有限公司）；HPDC-32G-2 型等離子清洗機(jī)（Harrick Plasma 公司）；Agilent-1260Ⅱ高效液相色譜儀、Agilent 6550 UPLC-Q-TOF-MS 質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)地白花敗醬草乙酸乙酯部位指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取各產(chǎn)地藥材適量，以10 倍量60%乙醇回流提取2 次，放冷，濾過，合并提取液，回收乙醇至無醇味，加純水稀釋至質(zhì)量濃度為0.1 g（生藥量）·mL溶液，備用。再分別量取5 份100 mL 白花敗醬草提取液，其中一份置于燒杯內(nèi)，水浴濃縮至10 mL。5 份溶液分別置于分液漏斗中，各加入1∶1（

V/V

）的乙酸乙酯，輕輕振蕩搖勻，靜置分層，取上層溶液，水浴濃縮至10 mL，過0.22 μm 微孔濾膜，作為供試品溶液，4℃保存，備用。

2.1.2 色譜條件 Agilent poroshell SB-C（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0 ～55 min，5%～50%A），流速0.6 mL·min，柱溫30 ℃，紫外檢測波長254 nm，進(jìn)樣量5 μL。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（

RSD

）。結(jié)果

RSD

值均小于1.0%，表明儀器精密度良好。2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣6 次，測定各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果其

RSD

均小于2.4%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣檢測，測定各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果其

RSD

均小于1.9%，表明方法重復(fù)性良好。2.2.4 指紋圖譜的建立 取供試品溶液進(jìn)樣分析，得到10 個(gè)不同產(chǎn)地白花敗醬草乙酸乙酯部位的指紋圖譜，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），見圖1。10 批白花敗醬草樣品的相似度在0.946 ～0.997，表明10 批樣品基本一致，見表2。從表2 可以看出，山東、河南、四川產(chǎn)樣品相似度相對(duì)較低，其他樣品相似度相對(duì)較高。從峰面積及保留時(shí)間

RSD

可以看出各峰保留時(shí)間差異較小，但峰面積差異較大，表明各成分含量有所差異，見表3。

圖1 10 批不同產(chǎn)地白花敗醬草的HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 10 batches of Patriniavllosa from different origins

表2 10 批白花敗醬草相似度結(jié)果
Tab 2 Similarity of 10 batches of

產(chǎn)地相似度產(chǎn)地相似度廣西0.999四川0.954江蘇0.998內(nèi)蒙0.985大別山0.978河南0.967安徽0.997江西0.998河北0.987山東0.946

2.3 白花敗醬草乙酸乙酯部位抗結(jié)腸癌藥效研究

2.3.1 細(xì)胞凋亡芯片的設(shè)計(jì)與制作 芯片采用實(shí)驗(yàn)室微流控技術(shù)，通過軟光刻、模塑法以及氧等離子體鍵合三大技術(shù)手段制得。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建一種多功能的高通量藥物篩選芯片，分為上下兩部分，依次為PDMS 流體通道層和玻璃基底層。主要通道包括流體通道區(qū)和細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，其中包括8 個(gè)入口、1 個(gè)廢液出口；細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)由8 列細(xì)胞培養(yǎng)腔組成，每列設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，每個(gè)培養(yǎng)腔為1.0 mm×1.2 mm 的橢圓形；8 組培養(yǎng)腔共用一個(gè)廢液口（見圖2）。

圖2 微流控芯片示意圖與實(shí)物圖Fig 2 Schematic diagram and physical picture of microfluidic chips

2.3.2 細(xì)胞凋亡芯片的適用性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的SW620 細(xì)胞，調(diào)整密度為3×10個(gè)·mL接種于芯片中，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液以0.2 μL·min的流速經(jīng)微量注射泵注入芯片中進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。細(xì)胞在芯片上分別培養(yǎng)24、36、48 h 后，用1∶100 稀釋倍數(shù)的AO/EB 混合染色液進(jìn)行染色，并使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，見圖3。通過Image J 軟件的細(xì)胞計(jì)數(shù)功能計(jì)算芯片中細(xì)胞的存活率，細(xì)胞在芯片中的生長狀態(tài)良好，細(xì)胞存活率均在96%以上。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)空白組細(xì)胞生存情況Fig 3 Survival of cells in the blank group at different time points

2.3.3 體外藥效學(xué)評(píng)價(jià) 待芯片中細(xì)胞密度在80%左右時(shí)，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用含10%胎牛血清的SW620 培養(yǎng)液將“2.1.1”項(xiàng)下供試品配制成1.0 mg·mL的藥液，經(jīng)蠕動(dòng)泵灌注入芯片，作用48 h 后停止給藥。采用Hoechst33342/PI進(jìn)行雙染，使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，通過Image J 軟件計(jì)算其凋亡壞死率，結(jié)果各產(chǎn)地藥材作用后細(xì)胞凋亡壞死率分別為95.4%（廣西）、89.9%（江蘇）、80.92%（大別山）、76.8%（安徽）、66.8%（河北）、60.8%（四川）、57.7%（內(nèi)蒙）、55.3%（河南）、52.4%（江西）、50.2%（山東），見圖4。

圖4 Hoechst33342/PI 雙染熒光檢測結(jié)果（×100）Fig 4 Hoechst33342/PI double staining fluorescence detection（×100）

2.4 白花敗醬草乙酸乙酯部位HPLC 色譜圖與其抗結(jié)腸癌作用的譜效關(guān)系分析

2.4.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 從表3 中選取分離度及對(duì)稱性較好的峰進(jìn)行標(biāo)號(hào)，并對(duì)36 個(gè)峰進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，見圖5。采用Grey Modeling-V3.0 灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件，將影響整體行為的數(shù)據(jù)進(jìn)行分列，以細(xì)胞的凋亡壞死率為母序列，白花敗醬草不同峰面積為子序列，對(duì)不同產(chǎn)地白花敗醬草的色譜峰與藥效進(jìn)行灰色相對(duì)關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果見表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各共有峰與抗結(jié)腸癌藥效均具有一定的關(guān)聯(lián)性，且抗結(jié)腸癌作用是各種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，但是其中幾種化學(xué)成分起主導(dǎo)作用。根據(jù)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡壞死率的關(guān)聯(lián)度相關(guān)系數(shù)大于0.7 的色譜峰有12 個(gè)，峰號(hào)以關(guān)聯(lián)程度排序依次為10、4、19、5、24、26、25、2、3、23、13、14。

圖5 白花敗醬草乙酸乙酯部位HPLC 指紋圖譜Fig 5 HPLC fingerprint of ethyl acetate extract of Patriniavllosa

表3 10 批白花敗醬草峰面積及保留時(shí)間計(jì)算結(jié)果
Tab 3 Peak area and retention time of 10 batches of

峰號(hào)峰面積峰面積RSD/%保留時(shí)間RSD/%安徽河北大別山廣西河南江蘇江西內(nèi)蒙山東四川10209.35800275.630001214.576543.754 1543.25634.50.070 20316.1580513.7880124.54700135.532178.36431.90.020 3435.275519.462364.145589.648467.046686.869797.483664.763947.250 1028.56158.00.040 4503.893554.477659.241748.625869.250949.054 1257.596 1227.333 1586.167 1680.62354.80.11 51035.056415.665 1276.483843.904 1293.250 1354.078 3165.438 3294.707 3673.410 3686.93647.21.3 6179.897092.679345.71200165.574178.689170.712010.90.050 70243.567211.456317.519149.537117.856316.5650260.176305.47856.20.090 8000163.357214.89700438.897271.51304.70.010 900437.56500365.79100171.513257.28919.20.11 10 1821.036350.575 2907.495 4599.940 1700.788 1181.181 1282.809951.057 2655.185 1460.41760.10.030 11208.959388.901118.417318.654 2157.654 2899.863 2286.136215.909 2398.705 2844.77210.60.090 12 1108.659 1236.357 1381.445 1930.763 1732.583 1331.647 1325.549 1210.258 1305.415 1377.22321.10.10 13208.959507.143384.579988.684280.774 1758.007496.574 1355.764238.492 1352.05964.20.090 14269.9860179.09800651.789411.89800216.5875.20.020 15137.533600.436219.247131.027409.483 1078.633959.184 1104.047 1385.586 1052.18431.70.60 16 2364.583 3671.573 3771.212 3924.493 5605.830 3098.115 2300.538 3425.569 6270.339 12 206.0208.40.050 17 2343.794 2594.736 3711.122 3220.446 4226.789 5228.353 4552.820 3169.885 5535.244 5368.31660.60.42 18000254.587158.784215.689147.673189.742333.120985.5433.90.010 190211.991328.14600378.41300513.053 1578.37833.10.070 200149.5130170.158211.111326.410470.015510.987314.537785.08759.80.030 21458.82089.11257.898365.78799.676093.90787.9080021.90.020 22586.954260.545 1125.159 3580.434130.055362.695 8121.811131.914282.518587.8051.40.020 230190.593000258.0910295.475219.089209.75326.80.22 24 1820.893446.486 1190.743306.579261.188450.543 6644.256233.327692.791649.54658.30.040 25 4284.496 1392.385 2384.389 17 739.483 1448.392 1459.483 2672.372 3478.389 1238.387 4906.40561.20.040 26101.5790076.34287.23559.9010135.723112.892039.90.010 2700150.129309.054218.981517.415425.493259.482346.897175.3878.40.010 28489.473804.980 1536.436 1869.398210.021 1113.647 1161.072153.489 3200.061 3560.95527.70.060 290208.378126.8930269.852106.02344.86500044.90.050 30 3524.019959.871 2031.129 6198.483 3534.961 5335.143 7600.940 8375.732 8830.062 9340.8384.70.020 31987.473555.837684.434 1516.473404.487264.864198.549354.473576.207856.59318.80.050 32 1284.837256.832456.473416.046871.739698.830367.092974.467687.193 1654.38674.40.050 3379.90473.986104.875072.097081.934113.9860013.70.020 34335.483356.596694.596475.968750.859760.976456.986769.956583.457843.24521.40.15 3500000146.7560240.902300.975159.37531.80.010 360100.9810201.002225.145298.567230.491205.873160.058323.09443.30.010 3799.984200.892149.93292.9020103.92300100.823060.80.10 38555.095758.596489.592645.483643.485576.696348.489684.234604.793945.4598.40.010 39000100.019236.594600.5780145.592354.589401.08934.50.13 400712.981000001357.483929.537721.0737.70.040 41100.7850089.87670.765121.098111.998077.763061.00.25 42211.270748.382 1531.807 2662.029802.691836.935336.065214.303817.731 1102.78278.80.12 43000159.09800527.057303.03378.973 1236.85344.10.010 44564.685383.968779.587643.583475.326984.346389.256343.594639.489985.5843.90.040 450175.1450140.1250290.124790.593505.857246.583987.69025.80.070 4600181.194209.0010183.414645.5780210.402509.7037.30.030

2.4.2 偏最小二乘法回歸分析 為了進(jìn)一步明確白花敗醬草化學(xué)成分和藥效之間的正負(fù)相關(guān)性，將表4 中關(guān)聯(lián)系數(shù)大于0.7的各成分峰面積作為變量

X

，獲取的不同產(chǎn)地白花敗醬草乙酸乙酯部位的藥效數(shù)據(jù)作為變量

Y

，導(dǎo)入SIMCA14.1 軟件中，經(jīng)UVN 標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行偏最小二乘法回歸分析，OPLS-DA 模型中

R

X

＝0.798，模型預(yù)測參數(shù)

Q

＝0.81，均大于0.5，表明建立的模型有效穩(wěn)定。通過偏最小二乘法進(jìn)一步驗(yàn)證12 個(gè)峰與藥效的相關(guān)性，得到其標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖，見圖6。除24 號(hào)峰，其余11 個(gè)峰均與藥效均成正相關(guān)。

表4 不同產(chǎn)地白花敗醬乙酸乙酯部位成分與藥效指標(biāo)的相關(guān)性分析
Tab 4 Correlation between composition in ethyl acetate extract of and efficacy of indicators from different origins

峰號(hào)關(guān)聯(lián)系數(shù)峰號(hào)關(guān)聯(lián)系數(shù)1 0.507 190.954 2 0.806 200.671 3 0.796 0.959 0.897 210.500 4 220.590 5 230.765 6 0.505 240.868 7 0.502 250.811 8 0.668 260.816 9 0.528 270.560 100.993 280.500 110.560 290.642 120.537 300.500 130.729 310.500 140.711 320.545 150.501 330.662 160.501 340.686 170.589 350.500 180.501 360.501

圖6 回歸系數(shù)（A）和VIP 值（B）分析結(jié)果Fig 6 Regression coefficient（A）and VIP value（B）analysis

為進(jìn)一步確認(rèn)貢獻(xiàn)度較大的成分，采用變量載荷評(píng)價(jià)參數(shù)值（VIP）進(jìn)行評(píng)價(jià)，該值可以體現(xiàn)變量對(duì)模型的整體貢獻(xiàn)水平。VIP 值越大，表明變量的貢獻(xiàn)程度越大，一般認(rèn)為，VIP 值大于1的化合物發(fā)揮了重要作用。其中有8 個(gè)共有峰的VIP 值＞1，分別為23、26、14、10、4、3、2、25 號(hào)峰，表明這些峰與藥效指標(biāo)成較強(qiáng)的正相關(guān)（VIP ＞1）。結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)上述成分抗結(jié)腸癌的報(bào)道，初步確定這8 種成分為白花敗醬草乙酸乙酯部位抗結(jié)腸癌作用的有效成分。

2.5 藥效成分鑒定

2.5.1 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用正/負(fù)離子模式檢測，干燥氣體流速為13 L·min，干燥氣體溫度為225℃，毛細(xì)管電壓為3500 V，霧化器壓力為40 psi，碎裂電壓為125 V，二級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓為20 eV，

m/z

范圍為50 ～1500。

2.5.2 成分鑒定 利用UPLC-Q-TOF-MS 對(duì)白花敗醬草乙酸乙酯部位進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜采集。通過二級(jí)質(zhì)譜的裂解，獲得化合物的離子碎片，結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)對(duì)“2.4.2”項(xiàng)下8 種藥效成分進(jìn)行快速鑒定，結(jié)果見表5。其中抗結(jié)腸癌活性較強(qiáng)的8 個(gè)成分分別為23（槲皮素）、26（木犀草素）、14（蘆?。?、10（槲皮苷）、4（綠原酸）、3（水楊酸）、2（原兒茶酸）、25（野黃芩苷）。

表5 藥效成分解析結(jié)果
Tab 5 Component analysis results of common peaks

注（Note）：為經(jīng)對(duì)照品比對(duì)（means compared with the reference substance）。

峰號(hào)保留時(shí)間/min分子式離子模式實(shí)際值（m/z）理論值（m/z）誤差碎片值化合物22.357C7H4O2[M－H]－155.0339 155.0344 －0.31 109.0303，91.6907原兒茶酸[12]32.726C7H6O3[M ＋H]＋139.0346 139.0394 －3.42 139.0893，110.9913，94.9352水楊酸[13]4*3.885C16H18O9 [M－H]－353.0801 353.0878 －2.10 191.0561，179.0356，173.0407，147.0610，161.0213 綠原酸10*5.756C21H20O11 [M ＋H]＋449.1032 449.1078 －1.02 303.0496，153.0541，137.0025槲皮苷14*7.899C27H30O16 [M ＋H]＋611.1606 611.1607 －0.02 465.1028，449.1078，303.0499，181.0131蘆丁23*11.73C15H10O7 [M ＋H]＋303.0438 303.0499 －2.01 275.0553，257.0430，229.2394，193.0134槲皮素2512.430 C21H18O12 [M ＋H]＋463.0867 463.0871 －0.08 287.0730，269.0448，153.0217，123.0287野黃芩苷[14]26*12.707 C15H10O6 [M ＋H]＋287.0535 287.0552 －0.59 259.0601，231.0652，153.0177，135.0435木犀草素

2.6 白花敗醬草單體成分體外抗結(jié)腸癌藥效驗(yàn)證研究

根據(jù)上述結(jié)果，分別考察了廣西產(chǎn)白花敗醬草乙酸乙酯部位、槲皮素、蘆丁、木犀草素、槲皮苷及4 種單體配伍組（按1∶1∶1∶1 配伍）體外抗結(jié)腸癌活性，按“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞驗(yàn)證，結(jié)果見圖7。在1.0 mg·mL質(zhì)量濃度條件下，各組細(xì)胞凋亡壞死率分別為95.4%、78.6%、69.2%、62.5%、60.3%、82.9%，均達(dá)到60%以上。證明這4 個(gè)化合物都能夠明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡壞死，與篩選結(jié)果一致，從而證明了利用灰色關(guān)聯(lián)及偏最小二乘回歸模型相關(guān)分析推測藥效成分的方法具有可行性。

圖7 白花敗醬草乙酸乙酯部位及活性單體成分驗(yàn)證Fig 7 Verification of ethyl acetate Patriniavllosa and active monomer components

3 討論

隨著顯微熒光影像分析、圖像數(shù)據(jù)處理等各項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，微流控芯片技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，本?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了單層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞凋亡芯片，并將其首次用于白花敗醬藥材的相關(guān)研究。蠕動(dòng)泵在細(xì)胞可承受的剪切力條件下以0.2 μL·min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)灌注，作用48 h 后的藥液消耗量還不足0.6 mL，用量是傳統(tǒng)96 孔板技術(shù)的百分之一，為稀有藥材的體外藥效實(shí)驗(yàn)提供了可行的方法。此外，芯片共用一個(gè)廢液排出口，大大降低了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

中藥發(fā)揮治療作用具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，發(fā)揮藥效是其多種成分共同作用的結(jié)果，指紋圖譜的特征與藥效存在一定的關(guān)聯(lián)。指紋圖譜反映的是藥材提取物的整體特征，所以在保證整體的前提下，其色譜峰與藥效關(guān)聯(lián)起來建立譜效關(guān)系具有一定的實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)將中藥指紋圖譜技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，建立了10種不同產(chǎn)地白花敗醬乙酸乙酯部位的指紋圖譜，并通過灰色關(guān)聯(lián)度法進(jìn)行初步分析，通過相關(guān)系數(shù)能直觀判斷各色譜峰相應(yīng)成分與藥效作用的相關(guān)性大小。偏最小二乘回歸分析法可以直觀顯示色譜峰與藥效指標(biāo)的密切程度和正負(fù)程度。因此本文利用灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)合偏最小二乘回歸分析法分析得出23（槲皮素）、26（木犀草素）、14（蘆?。?、10（槲皮苷）、4（綠原酸）、3（水楊酸）、2（原兒茶酸）、25（野黃芩苷）為藥效峰，并且8個(gè)色譜峰對(duì)體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)的影響較大，關(guān)聯(lián)度均達(dá)到0.7 以上。針對(duì)其藥效峰，本課題組采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)手段，進(jìn)行分析并驗(yàn)證，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研說明這8 個(gè)成分對(duì)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖起到重要的作用，揭示了白花敗醬草藥材抗結(jié)腸癌作用的本質(zhì)。

本研究建立了以藥理藥效為導(dǎo)向的研究方法，即保證了藥效的合理性，也保證了藥材的整體性及復(fù)雜性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)基于微流控芯片技術(shù)，探討白花敗醬草乙酸乙酯部位抗結(jié)腸癌藥效作用，不僅為微流控芯片技術(shù)在藥物領(lǐng)域的應(yīng)用擴(kuò)寬了范圍，也為深入研究白花敗醬草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。