維生素A通過鐵調(diào)節(jié)蛋白2基因表達(dá)來(lái)影響鐵代謝

藍(lán)嵐 鄒培斧 梁克紀(jì)

摘 要：目的：通過大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)（體外試驗(yàn)）來(lái)研究維生素A通過鐵調(diào)節(jié)蛋白2（IRP-2）來(lái)影響鐵代謝。方法：將SD大鼠原代分離肝細(xì)胞（seglent法），隨機(jī)分組嚴(yán)重缺乏A、邊緣缺乏B、常規(guī)組C、預(yù)防治療組D、RO阻抑組E，分別給予0、0.5、1.0、50 μmol/L全反式視黃酸和50 μmol/L全反式視黃酸+10 μmol/L RO（RARα阻斷劑）培養(yǎng)4 d。用RT-PCR法測(cè)量肝臟的IRP-2 mRNA的情況。結(jié)果：大鼠維生素A缺乏時(shí)，原代肝細(xì)胞表達(dá)IPR-2 mRNA水平增強(qiáng)（P<0.05），補(bǔ)充維生素A后， IPR-2 mRNA表達(dá)下降，但加入RO后，維生素A這種作用明顯減弱了。結(jié)論：維生素A作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，可通過結(jié)合視黃酸細(xì)胞核受體（RARα），改變IRP-2轉(zhuǎn)錄水平，改變鐵調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體貧血狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：維生素A;鐵調(diào)節(jié)蛋白2

維生素A缺乏（vitamin A deficiency，VAD）和貧血仍然是我國(guó)最主要的營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥，對(duì)我國(guó)學(xué)齡前兒童的健康影響極大，是亟待解決的公共衛(wèi)生問題。維生素A為一種人體必需脂溶性維生素，人體不能合成，通過參與糖蛋白合成及抗氧化作用，對(duì)機(jī)體多項(xiàng)機(jī)能進(jìn)行調(diào)節(jié)。維生素A的補(bǔ)充干擾細(xì)胞鐵狀態(tài)的調(diào)節(jié)，維生素A缺乏干擾鐵代謝最終導(dǎo)致貧血是貧血主要發(fā)生原因之一，但其明確的干擾機(jī)制還不是很清楚。研究證明，細(xì)胞維持鐵穩(wěn)態(tài)重要的調(diào)節(jié)機(jī)制是鐵調(diào)節(jié)蛋白2轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平來(lái)調(diào)節(jié)鐵的代謝[1-3]，本研究為驗(yàn)證維生素A能夠通過結(jié)合視黃酸細(xì)胞核受體（RARα），進(jìn)而誘導(dǎo)IRP-2轉(zhuǎn)錄的表達(dá)最終干擾鐵代謝[4]，并通過進(jìn)行受體阻抑試驗(yàn)，以進(jìn)一步明確維生素A對(duì)鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的影響是通過RARα通路調(diào)節(jié)，為探討維生素A缺乏導(dǎo)致缺鐵性貧血的機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑

Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原酶、DMEM培養(yǎng)液等，購(gòu)于Gibco BRL;RT-PCR試劑，大連寶生物工程有限公司;Ro41-5253（RARα選擇性拮抗劑，Ro），Enzolifescience.Co，引物來(lái)自上海英駿生物技術(shù)有限公司等。

1.2 原代肝細(xì)胞處理、分離、誘導(dǎo)

SD大鼠21 d齡24只，飼料配方參考美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的AIN-93G嚙齒類試驗(yàn)動(dòng)物飼料配方，并對(duì)其進(jìn)行組分的調(diào)整，其中如營(yíng)養(yǎng)素、能量能保證大鼠基本需要，但無(wú)機(jī)鹽中剔除鐵、維生素中剔除維生素A，共飼養(yǎng)8 w。試驗(yàn)前禁食12 h采用二步膠原消化法分離肝細(xì)胞[5]，將活力在95%以上的原代肝細(xì)胞（臺(tái)盼蘭）接種在膠原包被的培養(yǎng)皿內(nèi)。加入培養(yǎng)液等待24 h后，將原代貼壁后的肝細(xì)胞皿隨機(jī)分為5組：A組為維生素A嚴(yán)重缺乏組，培養(yǎng)液中只含有0.5%DMSO，沒有atRA;B組是維生素A邊緣缺乏，0.5 μmol/L atRA;C組為維生素A正常組，1 μmol/L atRA;D組為維生素A治療劑量組，培養(yǎng)液中0.5%DMSO、50 μmol/L atRA;E組為阻抑組，培養(yǎng)液含50 μmol/L atRA、10 μmol/L Ro。所有培養(yǎng)液共有成分：肝細(xì)胞和表皮生長(zhǎng)因子，10 %胎牛血清，青、鏈霉素（40萬(wàn)U/L）、胰島素（100 mg/L）、地塞米松（0.4 mg/L）。培養(yǎng)4 d后的肝細(xì)胞消化收集。

1.3 肝臟mRNA檢測(cè)

內(nèi)參照為β-actin，IRP2，其中，β-actin（512bp）的上游為5′-GTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3′;下游為5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′;IRP-2（459bp）上游為5′-GTTTGTCTCCAGGCAGTG-3′;下游為5′-ACCGTTTATTTCCCATCT-3′。PCR處理參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min，變性94℃30 s，退火是55℃30 s，延伸為72℃50 s，35個(gè)循環(huán)。72℃10 min后，4℃冰箱暫存。PCR產(chǎn)物跑凝膠電泳（β-actin作為參考比較）[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，多組整體比較采用隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代肝細(xì)胞形態(tài)、活力及功能

倒置顯微鏡下，新鮮分離的肝細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)，圓形或球形，透亮，細(xì)胞核位于中央，試驗(yàn)證明短時(shí)間快速的灌注活性較好。肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后貼壁、伸展、核變清晰，少數(shù)活力差的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，換液時(shí)可以去除。48 h后肝細(xì)胞緊緊粘附于培養(yǎng)板底壁，自動(dòng)排列成肝索樣結(jié)構(gòu)，呈典型的上皮細(xì)胞樣的多角形或者橢圓形形態(tài)，胞體變平變薄體積明顯增大，可見許多雙核細(xì)胞，開始出現(xiàn)島狀連接。這種良好的狀態(tài)可維持到試驗(yàn)結(jié)束。

2.2 各組大鼠肝臟表達(dá)IRP-2 mRNA情況

A、B、C、D組隨著維生素 A劑量的增加，IRP-2 mRNA呈表達(dá)下降的趨勢(shì)（P<0.05）;但維生素A缺乏組和邊緣缺乏組之間IRP-2 mRNA含量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。D組IRP-2 mRNA的表達(dá)最低，A組最大，E組介于A、D之間（P<0.05）?？梢?，維生素 A缺乏可以使原代培養(yǎng)肝細(xì)胞IRP-2 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，補(bǔ)充維生素 A可使其表達(dá)降低，但在加入RO后，這種降低的表達(dá)作用又稍增加。

3 討論

大量流行病學(xué)和臨床觀察試驗(yàn)證明，維生素A對(duì)細(xì)胞鐵代謝有關(guān)系，本研究可為探討大鼠缺乏維生素A加劇貧血提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。維生素A（全反式視黃酸作為其天然代謝產(chǎn)物）通過其細(xì)胞胞內(nèi)的結(jié)合蛋白-核受體（RARs、RXRs）及反應(yīng)元件（RARE）參與作用調(diào)控很多種基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的特定功能，如激素、受體、效應(yīng)器等[5-6]。另一方面，近年來(lái)又對(duì)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因有了初步的了解。分子細(xì)胞領(lǐng)域的鐵穩(wěn)態(tài)主要被幾種核心蛋白調(diào)控，其數(shù)量直接關(guān)系到肝細(xì)胞鐵代謝的穩(wěn)定，保證在細(xì)胞需要時(shí)有鐵供給，利用充足，但要避免鐵過量引起毒性。調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵平衡的主要蛋白—鐵調(diào)節(jié)蛋白2（IRP2）處于鐵代謝的核心地位。IRP-2是一種調(diào)控細(xì)胞質(zhì)RNA結(jié)合蛋白，具備轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、鐵蛋白mRNA的非翻譯區(qū)的鐵效應(yīng)元件IREs結(jié)合能力，在mRNA水平控制這兩種蛋白來(lái)調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞的鐵代謝。IRP-2是鐵穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，故本研究選擇了IRP-2來(lái)研究[7-8]。

本研究證明，維生素A作為一種轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)劑，能夠通過與視黃酸細(xì)胞核受體結(jié)合，激活視黃酸反應(yīng)元件，誘導(dǎo)IRP-2 mRNA基因的表達(dá)最終調(diào)控鐵代謝[9]。當(dāng)機(jī)體維生素A缺乏時(shí)，肝臟作為儲(chǔ)存器官，IRP-2 mRNA表達(dá)反而上調(diào)，結(jié)果使肝細(xì)胞從血中攝取、吸收、儲(chǔ)存鐵增多，使機(jī)體鐵儲(chǔ)存反而增加，利用減少，轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，進(jìn)而導(dǎo)致血液系統(tǒng)內(nèi)鐵含量降低，骨髓的鐵攝取減少，最終導(dǎo)致貧血。這種作用在陳科[10]的研究中也得到證實(shí)。本研究認(rèn)為，維生素A作為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)物，通過最終營(yíng)養(yǎng)鐵儲(chǔ)備、動(dòng)用產(chǎn)生效果。維生素A儲(chǔ)備狀況越好，機(jī)體鐵動(dòng)員效率越快，肝臟儲(chǔ)鐵越少，反之則加劇貧血的發(fā)生。但本研究不能完全排除維生素A可能通過調(diào)節(jié)其他代謝產(chǎn)物來(lái)干擾IRP-2的調(diào)控功能，因?yàn)槌艘陨虾诵耐緩?，還有很多途徑可以影響的IRP-2的活性，例如缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)和EPO的生成等。

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Effect of Vitamin A on Iron Metabolism by IRP-2 mRNA Pathway

LAN Lan1，2，ZOU Pei-fu3，LIANG Ke-ji4

（1 Shenzhen Baoan Authentic TCM Therapy Hospital，Shenzhen 518101，China;2 The Health Supervision Institute of Mudanjiang Municipal Health Bureau，Mudanjiang 157000，China;3 Dapeng District Women and Child Health Hospital，Shenzhen 518120，China;4 Dongguan Kanghua Hospital，Dongguan 523080，China）

Abstract：Objective To study the effect of vitamin A on IRP-2 expression in cultured primary rat hepatocyte.Ro41-5253，as retinoic acid receptor（RARα）selective antagonist，was used to confirm the role of RARα in effect of vitamin A on iron metabolism.Method SD rat primary hepatocytes were isolated by two-step in situ collagenase perfusion method by Seglent，were treated with 0，0.5，1.0，50 μmol/L atRA，and stimulated with RARα antagonist-Ro（10 μmol/L）+50 μmol/L atRA on group E.After 96 h，the expression on IRP-2 mRNA levels by RT-PCR were measured.Result Hepatic IRP2 mRNA levels were decreased by vitamin A supplementation，but the effect of vitamin A on IRP-2 mRNA can be diminished after adding retinoic acid receptor（RAR-α）selective antagonist.Conclusion Vitamin A deficiency can change IRP-2 mRNA expression by RARα.Vitamin A supplementation inhibited the increase in IRP-2mRNA expression.

Keywords：vitamin A;iron regulatory protein 2（IRP-2）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金“維生素A缺乏對(duì)鐵代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響研究”（項(xiàng)目編號(hào)：30872107）;黑龍江省自然科學(xué)基金“維生素A缺乏對(duì)鐵代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響研究”（項(xiàng)目編號(hào)：D200641）。

作者簡(jiǎn)介：藍(lán)嵐（1981— ），女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：傳染病防控。