血液NLRP3 Lp-PLA2聯(lián)合CER對(duì)阿爾茨海默病的診斷價(jià)值及與UPDRS功能的相關(guān)性

朱琳琳 季 晶 朱 婷 王媛媛 陳曉宏

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）已被臨床認(rèn)定為是一類原發(fā)性并伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)退行性病變的一類疾病，多發(fā)于65歲以上的老年群體，臨床表現(xiàn)為記憶力出現(xiàn)進(jìn)行性衰退、精神狀態(tài)及行為表現(xiàn)出現(xiàn)紊亂、視空間技能障礙等［1-2］。發(fā)病后患者生存質(zhì)量明顯下降，給及家庭、社會(huì)帶來(lái)較大負(fù)擔(dān)［3］?，F(xiàn)有的藥物治療方案在具體實(shí)施及治療效果方面并未達(dá)到預(yù)期，因而對(duì)AD早期診斷并采取針對(duì)性的有效干預(yù)措施對(duì)提高患者生存質(zhì)量、減輕其家庭負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)壓力具有重要作用［4］。人體腦神經(jīng)元的變化與腦免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常反應(yīng)有密切聯(lián)系，而這一變化是AD 患者出現(xiàn)腦血管損傷及發(fā)生神經(jīng)性炎性反應(yīng)的重要機(jī)制［5］。臨床炎性反應(yīng)標(biāo)志物之一的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprotein related phospholipase A2，Lp-PLA2）出現(xiàn)異常表達(dá)時(shí)是導(dǎo)致AD 發(fā)病的重要機(jī)制之一［6］。NOD 樣受體家族蛋白3（NOD-like receptor family protein 3，NLRP3）作為具有炎癥誘導(dǎo)性質(zhì)的一類信號(hào)通路，在人體內(nèi)的作用機(jī)制被認(rèn)定可能與AD 發(fā)病相關(guān)［7］。銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin，CER）是已知可以在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮銅運(yùn)輸作用的α2糖蛋白，亦可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)金屬抗氧化酶活性升高。CER所特有的抗氧化劑作用對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的有效合成帶來(lái)影響，一定程度上可能會(huì)加劇神經(jīng)元損傷程度［8］。上述3 項(xiàng)指標(biāo)對(duì)AD 的診斷效能及與AD 患者認(rèn)知、行為、精神狀態(tài)等是否存在聯(lián)系仍待商榷。本研究通過(guò)檢測(cè)AD患者血清NLRP3、Lp-PLA2 及血漿CER水平并分析其診斷價(jià)值，探究其與帕金森病綜合評(píng)分 量 表（unified Parkinson’s disease rating scale，UPDRS）的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2020-04—2022-04 在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院確診并接受治療的122例AD患者（AD患者組），另選取同期體檢的58例健康志愿者為健康對(duì)照組。AD患者組中男73例，女49例，年齡66～84（73.56±5.42）歲，病程1～10（6.24±2.53）a；受教育程度：初中及以下學(xué)歷者47 例，中專/高中學(xué)歷者59例，大專及以上學(xué)歷者17例。健康對(duì)照組所有對(duì)象臨床資料均完整，且自身及家族無(wú)精神疾病史，其中男34 例，女24 例，年齡65～82（72.84±5.03）歲；受教育程度：初中及以下學(xué)歷者18例，中專/高中學(xué)歷者29例，大專及以上學(xué)歷者11例。2組性別、年齡、受教育程度等對(duì)比均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。AD 患者病情程度應(yīng)用臨床癡呆評(píng)定量表（clinical dementia rating，CDR）評(píng)估，該量表主要對(duì)患者記憶、定向、判斷、問(wèn)題解決、社會(huì)事務(wù)、家庭愛(ài)好、個(gè)人料理能力等方面進(jìn)行評(píng)估，其中CDR=1 為輕度AD，CDR=2 為中度AD，CDR=3 為重度AD。根據(jù)CDR 分?jǐn)?shù)將AD 患者分為輕度AD 組、中度AD 組及重度AD組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡65歲及以上；（2）臨床癥狀及診斷結(jié)果均符合《2018 中國(guó)癡呆與認(rèn)知障礙診治指南（二）：阿爾茨海默病診治指南》中AD診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；（3）非其他病因?qū)е碌陌V呆，如外傷、代謝性疾病、慢性酒精中毒、甲狀腺功能低下、葉酸、維生素B12 缺乏等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神疾病或其意識(shí)具有相關(guān)征象者；（2）合并聽(tīng)力、語(yǔ)言表達(dá)能力低下等認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)者；（3）合并心、肺、肝、腎等嚴(yán)重器質(zhì)性功能障礙者；（4）合并嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤者；（5）入院前14 d內(nèi)接受過(guò)促智類藥物或抗精神病藥物治療方案者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 檢測(cè)方法所有研究對(duì)象均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下取肘靜脈血5 mL，收集到的血樣置于真空采血管中，4 h內(nèi)完成離心操作，參數(shù)設(shè)定為3 500 r/min，離心半徑10 cm，持續(xù)時(shí)間10 min，離心完成后去上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清Lp-PLA2、NLRP3 水平。具體步驟：檢測(cè)時(shí)分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品孔，其中空白樣品孔加樣品100 μL，其余各孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，劑量各100 μL，完成操作后混勻，之后在酶標(biāo)板覆膜并置于37 ℃恒溫下2 h，之后去除液體并甩干，分別加檢測(cè)溶液A工作液及B工作液各100 μL，A工作液加入后置于37 ℃恒溫下，1 h 后甩去孔內(nèi)液體并完成3 次洗板，之后再加入B工作液，仍按上述步驟完成操作。之后將底物溶液90 μL 加入各孔，在酶標(biāo)板覆膜并置于37 ℃避光環(huán)境下靜置待其顯色，之后加入終止溶液50 μL并用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度值。

血漿CER水平測(cè)定采用化學(xué)發(fā)光法，稱取約0.1 g樣本，加入1 mL 蒸餾水進(jìn)行冰浴勻漿。10 000×g、4 ℃離心10 min，取上清，測(cè)定OD645。全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（UniCel DxI 800）購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER 公司，并應(yīng)用相應(yīng)配套試劑及質(zhì)控品，檢測(cè)過(guò)程中相關(guān)操作均按照對(duì)應(yīng)說(shuō)明書完成。

1.3 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 UPDRS 功能評(píng)估：應(yīng)用UPDRS 進(jìn)行評(píng)估，具體包括精神、行為和情緒（UPDRS Ⅰ）評(píng)分，日常生活（UPDRS Ⅱ）評(píng)分，運(yùn)動(dòng)功能（UPDRS Ⅲ）評(píng)分。UPDRS每個(gè)項(xiàng)目分為5個(gè)等級(jí)（0～4分），受試者日常生活能力和運(yùn)動(dòng)功能隨著評(píng)分結(jié)果的升高而降低［10］。1.3.2 認(rèn)知功能評(píng)估：采用簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表（mini-mental state examination，MMSE）進(jìn)行評(píng)估，包括語(yǔ)言能力（8分）、定向力（10分）、記憶力（3分）、延遲記憶（3 分）、計(jì)算力（5 分）、結(jié)構(gòu)模仿（1 分）6 個(gè)維度，總分30 分。正常：≥27 分；輕度：21～26 分；重度：≤20分［11］。

1.4 觀察指標(biāo)（1）對(duì)比2 組血液各指標(biāo)水平；（2）對(duì)比2組MMSE評(píng)分及UPDRS功能總評(píng)分；（3）對(duì)比不同病情程度AD 患者血清各指標(biāo)水平；（4）對(duì)比不同病情程度AD 患者M(jìn)MSE 評(píng)分、UPDRS 功能總評(píng)分；（5）分析血清NLRP3、Lp-PLA2 及血漿CER對(duì)AD的診斷價(jià)值；（6）分析血清NLRP3、Lp-PLA2 水平，血漿CER水平與UPDRS功能的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理臨床數(shù)據(jù)均納入SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用ROC 曲線分析血清各指標(biāo)對(duì)AD 患者的診斷價(jià)值，血清NLRP3、Lp-PLA2 及血漿CER 水平與UPDRS 功能的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)比2 組患者各指標(biāo)表達(dá)情況AD 患者組血清NLRP3、Lp-PLA2 水平較健康對(duì)照組均顯著升高，血漿CER 水平與健康對(duì)照組比較顯著降低（均P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 2組患者各指標(biāo)表達(dá)情況對(duì)比 （±s）Table 1 Comparison of the expression of each index between the two groups （±s）

表1 2組患者各指標(biāo)表達(dá)情況對(duì)比 （±s）Table 1 Comparison of the expression of each index between the two groups （±s）

組別AD患者組健康對(duì)照組t值P值n 122 58血清NLRP3/（ng/L）121.54±37.25 76.55±18.67 8.685＜0.001血清Lp-PLA2/（μg/L）49.91±10.29 23.24±3.76 19.118＜0.001血漿CER/（g/L）0.21±0.08 0.27±0.11 4.148＜0.001

2.2 對(duì)比2 組患者M(jìn)MSE 評(píng)分、UPDRS 功能總評(píng)分 AD 患者組MMSE 評(píng)分顯著低于健康對(duì)照組，UPDRS功能各項(xiàng)評(píng)分及總評(píng)分均顯著高于健康對(duì)照組（均P＜0.001），見(jiàn)表2。

表2 2組患者M(jìn)MSE評(píng)分、UPDRS功能總評(píng)分對(duì)比（分，±s）Table 2 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores between the two groups （scores，±s）

表2 2組患者M(jìn)MSE評(píng)分、UPDRS功能總評(píng)分對(duì)比（分，±s）Table 2 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores between the two groups （scores，±s）

組別AD患者組健康對(duì)照組t值P值n UPDRS功能評(píng)分122 58 MMSE評(píng)分20.21±2.06 28.07±1.33 26.528＜0.001 UPDRS Ⅰ2.17±0.79 1.12±0.34 9.693＜0.001 UPDRS Ⅱ14.90±5.84 5.87±1.56 11.566＜0.001 UPDRS Ⅲ27.58±8.02 12.84±4.32 13.109＜0.001總分44.66±8.74 19.83±5.22 19.990＜0.001

2.3 對(duì)比不同病情程度AD 患者各指標(biāo)表達(dá)水平重度AD 組血清NLRP3、Lp-PLA2 水平均顯著高于輕-中度AD 組，血漿CER 水平均顯著低于輕-中度AD組（均P＜0.001），見(jiàn)表3。

表3 不同病情程度AD患者各指標(biāo)表達(dá)水平對(duì)比 （±s）Table 3 Comparison of the expressions of various indexes in AD patients with different disease degrees （±s）

表3 不同病情程度AD患者各指標(biāo)表達(dá)水平對(duì)比 （±s）Table 3 Comparison of the expressions of various indexes in AD patients with different disease degrees （±s）

組別輕-中度AD組重度AD組t值P值n 68 54血清NLRP3/（ng/L）108.12±32.27 138.45±40.06 4.632＜0.001血清Lp-PLA2/（μg/L）40.05±7.62 62.33±12.51 12.130＜0.001血漿CER/（g/L）0.24±0.08 0.17±0.05 5.615＜0.001

2.4 對(duì)比不同病情程度AD 患者M(jìn)MSE 評(píng)分、UPDRS功能總評(píng)分重度AD組MMSE評(píng)分顯著低于輕-中度AD 組，UPDRS 功能各項(xiàng)評(píng)分及總評(píng)分均顯著高于輕-中度AD組（均P＜0.001），見(jiàn)表4。

表4 不同病情程度AD患者M(jìn)MSE評(píng)分、UPDRS功能總評(píng)分對(duì)比（分，±s）Table 4 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores in AD patients with different disease degrees （scores，±s）

表4 不同病情程度AD患者M(jìn)MSE評(píng)分、UPDRS功能總評(píng)分對(duì)比（分，±s）Table 4 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores in AD patients with different disease degrees （scores，±s）

組別輕-中度AD組重度AD組t值P值n UPDRS功能評(píng)分/分68 54 MMSE評(píng)分23.87±2.26 17.31±2.07 16.523＜0.001 UPDRS Ⅰ1.86±0.71 2.57±0.92 4.672＜0.001 UPDRS Ⅱ12.18±3.27 18.33±3.61 9.740＜0.001 UPDRS Ⅲ24.46±7.18 31.52±8.32 4.942＜0.001總分38.50±7.46 52.42±9.05 9.042＜0.001

2.5 血清NLRP3、Lp-PLA2及血漿CER水平對(duì)AD的診斷價(jià)值采用ROC 曲線分析顯示，聯(lián)合檢測(cè)曲線下面積明顯高于NLRP3、Lp-PLA2、CER 單項(xiàng)檢測(cè)的曲線下面積（AUC=0.914），見(jiàn)表5、圖1。

圖1 NLRP3、Lp-PLA2、CER單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AD診斷價(jià)值的ROC曲線Figure 1 ROC curve of NLRP3, Lp-PLA2, CER single and combined detection in the diagnosis of AD

表5 血清NLRP3、Lp-PLA2及血漿CER單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AD的診斷價(jià)值Table 5 The diagnostic value of serum NLRP3, Lp-PLA2 and plasma CER single and combined detection for AD

2.6 血清NLRP3 及Lp-PLA2、血 漿CER 水平與UPDRS 功能的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析顯示血清NLRP3、Lp-PLA2 水平均與UPDRS 功能評(píng)分呈正相關(guān)，血漿CER水平與UPDRS功能評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)圖2～4。

圖2 血清NLRP3水平與UPDRS功能評(píng)分的相關(guān)性Figure 2 Correlation between serum NLRP3 level and UPDRS functional score

3 討論

中國(guó)腦血管相關(guān)疾病患者人數(shù)呈明顯升高趨勢(shì)，AD 發(fā)病率也隨之升高，給患者的生命安全及生存質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重不良影響［12，20-22］。現(xiàn)階段針對(duì)AD患者只能通過(guò)其出現(xiàn)明顯癡呆癥狀后基于營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、記憶改善等方案對(duì)癥治療，但臨床效果并不顯著，只能減緩患者腦功能衰退程度，很難恢復(fù)認(rèn)知功能［13，23-25］。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)水平的變化往往先于臨床癥狀的出現(xiàn)，提示明確有效的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)機(jī)體病變具有更高的敏感度和特異性［14，26-27］。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為類胰島素生長(zhǎng)因子1 可作為AD 的早期評(píng)估指標(biāo)并在臨床應(yīng)用，但該指標(biāo)表達(dá)水平受多種因素影響，如動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生也會(huì)使該指標(biāo)異常升高，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)使得該指標(biāo)在臨床評(píng)估中的實(shí)際準(zhǔn)確率降低，因此臨床上一直致力于尋找新的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

圖3 血清Lp-PLA2水平與UPDRS功能評(píng)分的相關(guān)性Figure 3 Correlation between serum Lp-PLA2 level and UPDRS functional score

圖4 血漿CER水平與UPDRS功能評(píng)分的相關(guān)性Figure 4 Correlation between plasma CER levels and UPDRS functional score

NLRP3 是人 體10 號(hào)染色體1q44 上的NLRP3 基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性提升的微粒蛋白、半胱天冬酶共同組成NLRP3 炎癥小體，被認(rèn)為可以提高促炎蛋白酶活性，是激活機(jī)體炎性反應(yīng)的重要機(jī)制之一。NLRP3 對(duì)激活腫瘤壞死因子-α的分泌具有促進(jìn)作用，而這一機(jī)制也是促成T 淋巴細(xì)胞激活、實(shí)現(xiàn)并促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答，加劇炎性反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡活性上升的重要機(jī)制［15］。本研究顯示，與健康人群相比，AD 患者血清NLRP3 水平明顯升高，且隨著患者病情程度的加劇而呈現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)血清NLRP3 加劇炎性反應(yīng)并對(duì)患者病情發(fā)展帶來(lái)不良影響。

Lp-PLA2 是一種由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌而成的絲氨酸脂酶［16］。有學(xué)者圍繞腦組織缺血缺氧病變機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)此時(shí)Lp-PLA2 可以通過(guò)對(duì)氧化型的低密度脂蛋白進(jìn)行水解來(lái)提高各種促炎因子的表達(dá)水平，促炎介質(zhì)刺激單核-巨噬細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，凋亡的泡沫細(xì)胞過(guò)度合成是造成動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊堆積的重要因素。本研究顯示AD 患者血清Lp-PLA2 水平隨病情程度的加劇而呈現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)，分析原因可能為L(zhǎng)p-PLA2 是促進(jìn)蛋白酶釋放的重要機(jī)制，而這也是促進(jìn)斑塊纖維帽膠原基質(zhì)降解的重要因素，很可能引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂，進(jìn)而加劇腦組織局部循壞不暢，導(dǎo)致AD 的發(fā)生［17］。

本研究納入的AD 患者血漿CER 水平與健康人群相比明顯降低，且隨著患者病情程度的加劇呈下降趨勢(shì)。師強(qiáng)等［18］研究發(fā)現(xiàn)AD 患者機(jī)體內(nèi)影響心腦血管及相關(guān)代謝風(fēng)險(xiǎn)因子呈異常高表達(dá)，這些均是促成氧化應(yīng)激生成的負(fù)氧離子堆積的重要機(jī)制，提示AD 病理生理機(jī)制受氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。CER 作為人體內(nèi)一列重要的抗氧化因子，已被臨床認(rèn)為是可以減輕機(jī)體氧化應(yīng)激的重要因子，也成為評(píng)估機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要檢測(cè)標(biāo)志物［19］。本研究顯示，隨著患者病情加劇，血漿CER水平有下降的趨勢(shì)，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能持續(xù)下降，提示CER 與AD發(fā)病及病情進(jìn)展有密切聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)血清NLRP3、Lp-PLA2 聯(lián)合血漿CER檢測(cè)模式對(duì)AD的診斷效能較高，提示3項(xiàng)指標(biāo)可成為早期診斷AD的重要標(biāo)志物。本研究證實(shí)AD患者的認(rèn)知功能隨著病情程度的加劇而衰退，患者精神、行為、日常生活、運(yùn)動(dòng)功能與健康人群存在顯著差異。上述3項(xiàng)血液指標(biāo)與UPDRS功能均顯著相關(guān)，表明患者各項(xiàng)功能越差，炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激反應(yīng)越嚴(yán)重，提示后續(xù)可將NLRP3、Lp-PLA2、CER作為AD患者病情嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)。

AD 患者血清NLRP3、Lp-PLA2 及血漿CER 水平較健康人群異常表達(dá)，3項(xiàng)血液指標(biāo)在不同病情程度患者的表達(dá)也存在顯著差異，與UPDRS 功能密切相關(guān)，提示其后續(xù)可成為早期診斷AD 的重要指標(biāo)，對(duì)評(píng)估AD患者UPDRS功能也具有較大的臨床意義。