五羥色胺轉(zhuǎn)運體及神經(jīng)肽S受體基因多態(tài)性與原發(fā)性失眠的致病機制研究

范 杰 謝宇平 惠培林 馬 薇 王金鳳 蘇曉艷 陳雪萍王旭斌 郭 斌 趙 媛

1）甘肅省人民醫(yī)院睡眠醫(yī)學(xué)中心，甘肅 蘭州 730000 2）甘肅省睡眠臨床醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730000

失眠分為繼發(fā)性失眠和原發(fā)性失眠（primary insomnia，PI）。PI是指以睡眠障礙（難以入睡和/或維持睡眠困難或睡眠后精力未恢復(fù)）為幾乎唯一的癥狀，每周至少出現(xiàn)三晚睡眠困難，時間在3個月以上，并具有臨床意義的苦惱及社交、職業(yè)或其他功能的損害；排除由其他睡眠與精神/心理障礙以及軀體的疾病、酒精或藥物等導(dǎo)致的失眠［1］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PI患者有家族聚集現(xiàn)象［2］，BEAULIEU-BONNEAU 等［3］對953例成人的調(diào)查中，35%報道至少有一個一級親屬有過或者罹患失眠，提示原發(fā)性失眠具有遺傳特征［4］。

五羥色胺（5-hydroxy tryptamine,5-HT）的睡眠調(diào)節(jié)作用已有很長的研究里程［5-6］，其功能是促覺醒，抑制 慢 波 及 快 動 眼 睡 眠［6］。5-HT 轉(zhuǎn) 運 體（5-HT transporter，5-HTT）位于突觸前膜，它通過對突觸間隙中5-HT 的再攝取來調(diào)節(jié)作用于突觸后的5-HT 濃度，對5-HT 的功能發(fā)揮起關(guān)鍵作用。神經(jīng)肽S（neuropeptide S，NPS）及神經(jīng)肽S受體（neuropeptide S receptor，NPSR）是最新發(fā)現(xiàn)的一種睡眠調(diào)節(jié)系統(tǒng)［7］。NPS經(jīng)NPSR激活下丘腦后部組胺能、食欲素能神經(jīng)元產(chǎn)生覺醒［8］。研究發(fā)現(xiàn)NPS-NPSR 系統(tǒng)與5-HT 系統(tǒng)不僅參與睡眠覺醒周期的調(diào)節(jié)，還參與驚恐、焦慮及抑郁的病理生理過程［9-14］。

通過選擇5-HTT 基 因5 個SNP 位點rs140700、rs2020936、rs3794808、rs6352、rs25531，NPSR 基因13 個SNP 位 點rs323922、rs324377、rs324396、rs740347、rs324957、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499、rs2168890進行基因分型，探討基因多態(tài)性與PI 的關(guān)系及5-HTT、NPSR 基因多態(tài)性檢測作為PI 臨床重要的指標，為PI診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 原發(fā)性失眠組患者：選取2016-01—2019-12在甘肅省睡眠醫(yī)學(xué)中心就診的失眠病人和我中心承擔甘肅人群睡眠狀況普查（2015—2017）所檢測到的PI患者為研究對象，詳細告知研究內(nèi)容和目的，根據(jù)《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第5版標準，進行精神疾病篩查問診及臨床檢查，行整夜多導(dǎo)睡眠監(jiān)測（polysomnography，PSG）篩查。共468例患者在甘肅省人民醫(yī)院接受了多導(dǎo)睡眠監(jiān)測。排除：（1）由于其他睡眠/精神障礙以及酒精或藥物等醫(yī)學(xué)問題引起的繼發(fā)性失眠，尤其要鑒別排除焦慮障礙所致失眠（鑒別方法根據(jù)《中國失眠防治指南》）；（2）有嚴重軀體疾病患者，如高血壓、心臟病、甲狀腺功能異常、糖尿病等；（3）有其他明確的失眠原因，如近期有重大心理應(yīng)激而致失眠者；（4）不適合量表評估的低齡和高齡人群；（5）PSG 監(jiān)測結(jié)果為主觀性失眠患者；（6）PSG 監(jiān)測結(jié)果呼吸暫停低通氣指數(shù)（apnea hypopnea index，AHI）＞15者；（7）有與國外種族聯(lián)姻家族史者；（8）未簽署知情同意書者。最終樣本包括157例原發(fā)性失眠患者，失眠組年齡18～65（44.32±10.42）歲，包括男109例（69.43%)和女48例（31.57%)。

1.1.2 健康對照組患者：133名年齡和性別匹配的正常對照者是在本醫(yī)院體檢中心招募的，無任何精神疾病或重大身體疾病的病史，且2 組間無血緣關(guān)系。對照組年齡18～65（43.38±9.96）歲。對照組中有90名健康男性（67.67%)和43 名健康女性（33.33%）。原發(fā)性失眠患者組與健康對照組之間，年齡、性別比例無顯著差異（P=0.438）。

1.1.3 倫理聲明：本研究采集所有樣本及收集的臨床資料均獲得本人知情同意簽署知情同意書，并獲甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試驗材料

1.2.1 NPSR 基因多態(tài)位點選擇：從HapMap 計劃以及美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）單核甘酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫選擇5-HTT 基因及NPSR 基因功能性SNP，納入標準為：①外顯子區(qū)能改變氨基酸表達，在中國人群中最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞5%；②在非翻譯區(qū)，中國人群中MAF＞5%；③在5'啟動子2 kb 以內(nèi)，中國人群中MAF＞5%。5-HTT 基因多態(tài)性最終入選的位點有rs140700、rs2020936、rs3794808、rs6352。NPSR 基因多態(tài)性 最 終入 選 的SNP 位點 有rs323922、rs324377、rs324396、rs740347、rs324957、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499、rs2168890。

1.2.2 患者心理評價：對于原發(fā)性失眠患者，采用13項抑郁自評量表（Back depression inventory，BDI）測量抑郁癥狀，在研究前1個月內(nèi)用匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（Pittsburgh sleep quality index，PSQI）評估睡眠質(zhì)量。狀態(tài)-特質(zhì)焦慮問卷（state-trait anxiety inventory, STAI）排除焦慮相關(guān)失眠及抑郁相關(guān)失眠，并且評估PI患者因失眠導(dǎo)致的焦慮及抑郁狀態(tài)。

1.2.3 PSG 數(shù)據(jù)的采集：采用紅外線視頻/音頻同步記錄的整夜睡眠監(jiān)測（AV-PSG）對所有病例進行整夜睡眠監(jiān)測，監(jiān)測室溫度20～22 ℃；受試者按平時作息時間進入監(jiān)測室，當晚不服用睡眠藥物。整夜測試PSG記錄的時間不少于7 h，所用睡眠監(jiān)測儀均為美國偉康飛利浦所提供的Alice 5 多導(dǎo)睡眠監(jiān)測儀，多導(dǎo)睡眠圖指標包括W期、N1期、N2期、N3期、R期分別占總睡眠時間的比例。

1.2.4 DNA 提取和基因分型：對所有入組研究對象采集2 mL 肘靜脈血，EDTA 抗凝（全血∶EDTA=5∶1），置2 mL離心管內(nèi)，采集后迅速輕輕顛倒混勻后置于零下20 ℃冰箱保存。采用AXyprep全血基因組DNA試劑盒（Bio TeKe Corpration），按廠家推薦的方法從靜脈血中提取基因組DNA。委托北京博淼生物科技有限公司，進行SNP分型檢測，獲得分型數(shù)據(jù)，5-HTT的SNP位點rs25531評估后無法進行同時檢測，故未進行檢測，不納入基因分型數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計分析方法連續(xù)變量為±s，分類變量為百分比，對連續(xù)變量和分類變量分別進行雙尾t檢驗和χ2檢驗，采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。在在線SHEsis 程序中計算了基因多態(tài)性各位點Hardy Weinberg（HWE）平衡檢測以及等位基因和基因型分布的差異，統(tǒng)計分析包括HWE 平衡分析，單位點關(guān)聯(lián)分析，連鎖不平衡分析及位點單體型分析。在HWE 分析、單位點關(guān)聯(lián)分析和兩位點單體型分析中，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。連鎖不平衡分析中，認為D＇＞0.7，r2＞1/3即存在較強的連鎖不平衡。

2 結(jié)果

2.1 樣本數(shù)據(jù)特征本次研究樣本總?cè)藬?shù)共292例，剔除樣本純度及基因測序不合格者2 例，剩余290例，其中失眠組157例，占總?cè)藬?shù)54.14%；對照組133 例，占總?cè)藬?shù)45.86%，2 組研究樣本中年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）、STAI 均符合正態(tài)分布，采用組間獨立樣本t 檢驗，檢驗結(jié)果見表1，年齡（t=0.777，P=0.438）、性別（t=0.103，P=0.748）、BMI（t=-1.537，P=0.126）、STAI（t=29.857/28.576，P＜0.001）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而失眠嚴重程度指數(shù)評分（insomnia severity index，ISI）、PSQI、BDI均不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗中的兩獨立樣本秩和檢驗，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 研究樣本的臨床資料Table 1 Clinical data of the study sample

2.2 SNP 位點Hardy-Weinberg（HWE）平衡檢測HWE 平衡檢測示，5-HTT 基因多態(tài)性位點在2 組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞0.05），即2 組都符合HWE 法則，見表2。NPSR基因多態(tài)性位點，所有對照組均無差異，即符合HWE 法則，病例組SNP 位點rs324957、rs324981和rs324987不符合HWE法則，見表3。

表2 5-HTT-SNP位點HWE平衡檢測Table 2 HWE balance detection at 5-HTT-SNP sites

表3 NPSR-SNP位點HWE平衡檢測Table 3 HWE balance detection at NPSR-SNP sites

2.3 單位點關(guān)聯(lián)分析結(jié)果通過對5-HTT基因多態(tài)性位點在PI組與對照組的基因型和等位基因頻率進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)5-HTT基因上的4個SNP位點的基因型和等位基因頻數(shù)在2 組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表4。對NPSR基因多態(tài)性位點在PI組與對照組的基因型和等位基因頻率進行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SNP 位點rs323920 的T/C 型與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.042），SNP位點rs324957的A/G 型與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.023）。見表5。

表4 5-HTT多態(tài)性位點在PI組與對照之間的基因型和等位基因頻率 ［n（%）］Table 4 Genotype and allele frequencies of 5-HTT polymorphisms at 5-HTT polymorphisms between PI groups and controls ［n（%）］

表5 NPSR多態(tài)性位點在PI組與對照之間的基因型和等位基因頻率 ［n（%）］Table 5 Genotype and allele frequencies of NPSR polymorphisms between the PI group and controls ［n（%）］

（續(xù)表）

2.4 連鎖不平衡分析結(jié)果5-HTT基因上的單核苷酸 多 態(tài) 性 位 點（rs140700、rs2020936、rs394808、rs6352）之間存在連鎖不平衡，其中rs140700 與rs6352之間存在完全連鎖不平衡（圖1、2）。NPSR基因上的13 個位點（rs323922、rs324377、rs324396、rs324857、rs740347、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499、rs2168890）之間存在連鎖不平衡，其中rs324377與rs323917（D＇=1.000）、rs740347 與rs1963499（D＇=1.000）、rs740347與rs2168890（D'=1.000）、rs323920 與rs323917（D＇=1.000）、rs323917 與rs2168890（D＇=1.000）、rs2530547與rs1963499（D＇=1.000）、rs2530547與rs2168890（D＇=1.000）、rs1963499 與rs2168890（D＇=1.000）之間存在完全連鎖不平衡（圖3、4）。

圖1 5-HTT基因位點連鎖不平衡D'Figure 1 5-HTT locus linkage imbalance D'

圖3 NPSR基因位點連鎖不平衡D'Figure 3 NPSR locus linkage imbalance D'

2.5 SNP 位點單體型分析結(jié)果對5-HTT 基因4 個SNP位點進行分析共構(gòu)建出10種單倍型，其中CGTT單倍型在PI組和對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表6。對NPSR基因上13個位點構(gòu)建出7常見單倍型（頻數(shù)＞3%），其中CACGGTCCCCAGC單倍型在PI 組和對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表7。

表6 5-HTT基因位點單倍型分析Table 6 Haplotype analysis of 5-HTT loci

表7 NPSR基因位點單倍型分析Table 7 NPSR locus haplotype analysis

3 討論

本次研究通過檢測和分析選自5-HTT 基因上4個SNP 位點（rs140700、rs2020936、rs394808、rs6352）和NPSR 基因13 個SNP 位點（rs3243922、rs324377、rs324396、rs740347、rs32957、rs324981、rs324987、rs323920、rs323917、rs2530547、rs887020、rs1963499和rs2168890）探討其基因多態(tài)性是否與失眠相關(guān)聯(lián)。實驗證明：（1）rs323920 位點和rs32957 位點基因型多態(tài)性與失眠相關(guān)聯(lián)；（2）5-HTT 基因上的單核苷 酸多 態(tài) 性位 點（rs140700、rs2020936、rs394808、rs6352）之間存在連鎖不平衡，其中rs140700 與rs6352之間存在完全連鎖不平衡；NPSR基因上的13個位點rs324377 與rs323917（D＇=1.000）、rs740347 與rs1963499（D＇=1.000）、rs740347 與rs2168890（D＇=1.000）、rs323920 與rs323917（D＇=1.000）、rs323917 與rs2168890（D＇=1.000）、rs2530547 與rs1963499（D＇=1.000）、rs2530547 與 rs2168890（D＇=1.000）、rs1963499 與rs2168890（D＇=1.000）之間存在完全連鎖不平衡；（3）所構(gòu)建的單體型中，其中5-HTT基因4個位點構(gòu)建的CGTT 單倍型在PI 組和對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），NPSR 13 個基因位點構(gòu)建的CACGGTCCCCAGC 這單倍型在PI 組和對照組中的差異有統(tǒng)計意義（P＜0.001）。

圖2 5-HTT基因位點連鎖不平衡r2Figure 2 5-HTT locus linkage imbalance r2

圖4 5-HTT基因位點連鎖不平衡r2Figure 4 5-HTT locus linkage imbalance r2

目前對于原發(fā)性失眠的機制研究有許多，但由于其機制復(fù)雜，尚無明顯定論。研究證明原發(fā)性失眠患者具有遺傳傾向，其一級親屬自身發(fā)生失眠的風(fēng)險增加了6.65 倍［15］。目前已有研究證實了5-HTTLPR 基因。S-allele 基因和原發(fā)性失眠之間存在關(guān)聯(lián)［16］。原發(fā)性失眠癥和其他失眠癥的診斷表明與情緒障礙有關(guān)，失眠通常在抑郁癥發(fā)作前出現(xiàn)，因此失眠是抑郁癥的風(fēng)險因素，失眠和情感這些疾病可能具有共同的背景［17-21］。研究認為原發(fā)性失眠中有部分是抑郁癥，亞臨床狀態(tài)或抑郁潛伏期［22-28］。GUERRINI 等［20］研究表明，NPS-NPSR 系統(tǒng)也參與調(diào)節(jié)人類的生理性睡眠。NPSR rs324981 單核苷酸多態(tài)性與人類睡眠習(xí)慣改變相關(guān)［21-22，29-35］。研究表明NPS可能具有促進覺醒的作用，對人體睡眠與覺醒產(chǎn)生一定調(diào)節(jié)作用，可能與失眠等多種疾病發(fā)生具有密切相關(guān)性［23，36-40］，研究發(fā)現(xiàn)大鼠NPS免疫反應(yīng)神經(jīng)元主要分布于腦干藍斑核、三叉神經(jīng)感覺主核、腦橋網(wǎng)狀核尾側(cè)部及橄欖周核等，NPS經(jīng)NPSR激活下丘腦后部組胺能、食欲素能神經(jīng)元產(chǎn)生覺醒［8，41-43］。而查閱文獻未發(fā)現(xiàn)5-HTT 或NPSR SNP 位點連鎖不平衡和單倍型分析與失眠的相關(guān)研究，本試驗以原發(fā)性失眠患者為研究對象，選取5-HTT基因上的4個SNP位點和NPSR上的13個SNP位點進行基因分型，探討其與原發(fā)性失眠之間的相關(guān)性。首先，通過單個SNP關(guān)聯(lián)分析，分析了5-HTT基因多態(tài)性上的4個SNP 位點及NPSR 上的13 個SNP 位點；其次，通過連鎖不平衡檢驗分析及單倍體分析進一步證實5-HTT基因多態(tài)性和NPSR 基因多態(tài)性與原發(fā)性失眠的關(guān)聯(lián)。本研究進行的是SNP位點與原發(fā)性失眠之間的關(guān)聯(lián)研究，今后力求在發(fā)現(xiàn)SNP相關(guān)性的同時，通過一些體外的動物實驗進行驗證，并揭示其分子生物學(xué)機制，為原發(fā)性失眠的診斷、治療、預(yù)防等提供更加深入理論依據(jù)。

本研究樣本量大，結(jié)果可信度較高，將來對研究中兩個基因上的17個多態(tài)性位點的重復(fù)測定分析應(yīng)關(guān)注研究結(jié)果的一致性和可靠性。本研究主要局限是中國漢族人群分布廣泛，試驗樣本采取自一個地區(qū)或許不能夠有效代表廣泛的中國原發(fā)性失眠群體，因此將來的研究中應(yīng)在多個地區(qū)收集原發(fā)性失眠患者樣本。