尿酸測(cè)定試劑的抗干擾能力研究

潘亞麗

（英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技股份有限公司，福建廈門(mén) 361022）

尿酸（Uric Acid，UA）是嘌呤堿基代謝產(chǎn)物，既可以來(lái)自體內(nèi)，也可以來(lái)自于食物中嘌呤的分解代謝，主要在肝臟中生成，小部分尿酸可經(jīng)肝臟隨膽汁排泄，其余大部分均從腎臟排泄[1]。臨床上常將血清尿酸檢測(cè)結(jié)果作為痛風(fēng)、腎功能損傷診斷的一個(gè)重要指標(biāo)，因此尿酸檢測(cè)在臨床上具有重要的作用[2]。尿酸濃度的升高或降低均會(huì)對(duì)機(jī)體造成不利的影響，因而尿酸的準(zhǔn)確測(cè)定就顯得尤為重要[3]。檢測(cè)過(guò)程中，檢驗(yàn)樣本的狀態(tài)對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性可產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此必須對(duì)檢測(cè)干擾因素進(jìn)行研究。干擾物質(zhì)按照來(lái)源可分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)。尿酸測(cè)定試劑所適用的臨床樣本一般為血清，離體的血液經(jīng)不同的方法處理從而得到檢測(cè)所需的樣本。由于從全血中分離獲得，因此血液中的一些物質(zhì)可能會(huì)成為潛在的內(nèi)源性干擾物。本研究采用在血清樣本中添加抗壞血酸（VC），模擬人體服用維生素后的干擾物樣本；在血清樣本中添加血紅蛋白，模擬溶血的內(nèi)源性干擾物樣本；在血清樣本中添加膽紅素，模擬黃疸的內(nèi)源性干擾物樣本；在血清樣本中添加甘油三酯、脂肪乳，模擬脂血的內(nèi)源性干擾物樣本。對(duì)在臨床工作中常見(jiàn)的干擾作用進(jìn)行尿酸測(cè)定試劑抗干擾能力研究，以期為尿酸的測(cè)定和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用血清樣品來(lái)源于健康體檢者，空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈采血5 mL、3 000 r/min離心5 min后得到相應(yīng)血清，無(wú)脂血、溶血和黃疸血清樣本-20 ℃冰箱凍存。

1.2 儀器與試劑

尿酸測(cè)定試劑盒，英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技股份有限公司；日立7180型全自動(dòng)生化分析儀，日立集團(tuán)有限公司；校準(zhǔn)品及質(zhì)控品，英國(guó)朗道公司。干擾物質(zhì)：抗壞血酸（VC），99.7%，默克Sigma；血紅蛋白（HB），98%，默克Sigma；膽紅素（TB），98%，Aladdin；甘油三酯（TG），99%，默克Sigma；10%脂肪乳，四川科倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 尿酸測(cè)定方法

尿酸測(cè)定試劑盒采用尿酸酶法，反應(yīng)生成的紅色醌亞胺色素與樣本中尿酸的濃度成正比，測(cè)定吸光度，并計(jì)算尿酸的濃度。

1.3.2 基礎(chǔ)血清的制備

根據(jù)《干擾實(shí)驗(yàn)指南》（WS/T 416—2013），按尿酸濃度選取2個(gè)濃度的樣本：將尿酸濃度約500 μmol/L的樣本混合，制備成高值基礎(chǔ)混合血清；將尿酸濃度約200 μmol/L的血清樣本混合，制備成低值基礎(chǔ)混合血清。

1.3.3 干擾物篩選樣本制備

根據(jù)《干擾實(shí)驗(yàn)指南》（WS/T 416—2013），選擇醫(yī)學(xué)決定水平、參考范圍的上限或病理濃度，確定干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)干擾物的濃度。Vc干擾樣本的濃度為1 704 μmol/L（0.3 g/L），HB干擾樣本的濃度10 g/L，TB干擾樣本濃度為684 μmol/L，TG干擾樣本濃度為37 mmol/L，脂肪乳干擾樣本濃度為0.03%。干擾物分別配制成20倍的貯存液，將不同濃度的5種干擾物質(zhì)分別與高、低混合血清按1∶19稀釋，得到10組高濃度干擾樣本。

1.3.4 干擾評(píng)價(jià)（劑量效應(yīng)）樣本制備

當(dāng)干擾物篩選試驗(yàn)顯示被評(píng)價(jià)干擾物對(duì)尿酸有明顯干擾作用時(shí)，制備一系列不同濃度的干擾測(cè)試樣本。對(duì)照樣本（干擾物質(zhì)的緩沖液與混合血清按1∶19稀釋）和干擾樣本（干擾物質(zhì)貯備液與混合血清按1∶19稀釋）配制為5個(gè)濃度梯度樣本，對(duì)照樣本與干擾樣本分別按體積比例（4∶0、3∶1、2∶2、1∶3和0∶4）混合為5個(gè)濃度[4]。

1.3.5 操作

（1）在儀器狀態(tài)最佳條件下，用尿酸試劑對(duì)上述樣品進(jìn)行測(cè)定。（2）每種干擾樣本均為現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)。（3）為排除測(cè)量程序的精密度對(duì)干擾效果的影響，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的置信水平、檢驗(yàn)效能及測(cè)量程序的批內(nèi)精密度和干擾標(biāo)準(zhǔn)[5]，計(jì)算出dmax/S=2.5，查詢95%置信水平與檢驗(yàn)效能下不同干擾標(biāo)準(zhǔn)所需要的樣品，重復(fù)測(cè)定次數(shù)為5次。（4）劑量效應(yīng)試驗(yàn)在同一分析批之內(nèi)檢測(cè)5個(gè)樣本的濃度，第一組按照升序測(cè)定各樣本，第二組按降序測(cè)定，以此類推，從而能夠平均系統(tǒng)漂移產(chǎn)生的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel 2013軟件處理和作圖分析，檢測(cè)結(jié)果取均值。配對(duì)差異計(jì)算添加樣本和對(duì)照樣本測(cè)量均值差的絕對(duì)值（B），B=干擾管測(cè)定結(jié)果-對(duì)照管測(cè)定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)篩選試驗(yàn)顯示被評(píng)價(jià)干擾物對(duì)被評(píng)價(jià)方法有明顯干擾作用，則進(jìn)一步通過(guò)劑量效應(yīng)試驗(yàn)確定小于偏倚臨界值（相對(duì)偏差均在±10%范圍內(nèi)（干擾率≤10%），即高值差值在±50 μmol/L，低值差值在±20 μmol/L）即可接受。確定不同干擾物濃度的干擾程度，以干擾物濃度為x軸，以各干擾物濃度結(jié)果與對(duì)照樣本結(jié)果的差值為y軸，繪制散點(diǎn)圖，然后依次對(duì)各點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)連線，采用點(diǎn)對(duì)點(diǎn)法估計(jì)不同濃度干擾物的干擾效果。計(jì)算的干擾濃度，即為該干擾物質(zhì)不對(duì)分析物造成干擾的最大濃度。如果不同的分析物濃度試驗(yàn)得到的可接受干擾物濃度不同，則取其中最低的可接受干擾物濃度作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 干擾物篩選結(jié)果

通過(guò)計(jì)算添加樣本和對(duì)照樣本測(cè)量均值差的絕對(duì)值，HB、TG、脂肪乳樣本和對(duì)照樣本測(cè)量均值差＜偏倚臨界值，無(wú)明顯干擾作用。Vc、TB的測(cè)量均值差＞偏倚臨界值，VC和TB有明顯干擾作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 VC、HB、TB、TG、脂肪乳干擾物篩選結(jié)果（單位：μmol/L）

2.2 劑量效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

隨著干擾物VC和TB濃度的增加，其干擾程度也逐漸增加，見(jiàn)表2。

表2 VC、TB干擾物干擾評(píng)價(jià)（單位：μmol/L）

2.3 VC對(duì)尿酸測(cè)定的影響

在尿酸濃度約為200 μmol/L及500 μmol/L分析水平下，VC對(duì)尿酸試劑產(chǎn)生負(fù)向干擾，其干擾呈非線性干擾趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖1（a）和圖1（b）。低值樣品（約200 μmol/L）回歸方程為y=-0.022x-2.912，高值樣品（約500 μmol/L）回歸方程為y=-0.040 5x-3.152，干擾效果可以從圖1中進(jìn)行估計(jì)，也可以通過(guò)回歸方程計(jì)算。通過(guò)斜率和截距關(guān)系，計(jì)算出低值樣本VC的干擾劑量為686.1 μmol/L，高值樣本VC的干擾劑量為1 072.4 μmol/L，則本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)血清中VC≤686 μmol/L不影響尿酸試劑的測(cè)定結(jié)果。

圖1 VC劑量效應(yīng)回歸分析

2.4 TB對(duì)尿酸測(cè)定試劑的影響

在尿酸濃度約為 200 μmol/L及 500 μmol/L分析水平下，TB對(duì)尿酸試劑也產(chǎn)生負(fù)向干擾。其干擾呈非線性干擾趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖2（a）和圖2（b）。低值樣品（約200 μmol/L）回歸方程為y=-0.0706x+2.608，高值樣品（約500 μmol/L）回歸方程為y=-0.0831x+2.22，干擾效果可以從圖2中進(jìn)行估計(jì)也可以通過(guò)回歸方程計(jì)算。通過(guò)斜率和截距關(guān)系，計(jì)算出低值樣本TB的干擾劑量為368.4 μmol/L，高值樣本TB的干擾劑量為617.3 μmol/L，則本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)TB≤368 μmol/L不影響尿酸試劑的測(cè)定結(jié)果。

圖2 TB劑量效應(yīng)回歸分析

3 結(jié)論

由于人體血清成分復(fù)雜，其中的某些成分會(huì)引起試劑盒測(cè)定的干擾。本實(shí)驗(yàn)只選取了5種干擾物質(zhì)，在尿酸濃度約為200 μmol/L及約500 μmol/L分析水平下，當(dāng)HB≤10 g/L，TG≤37 mmol/L，脂肪乳≤0.03%時(shí)，尿酸測(cè)定結(jié)果不受影響，即干擾率≤ 10%。 當(dāng) Vc≤ 686 μmol/L，TB≤ 368 μmol/L時(shí),計(jì)算得到的相對(duì)偏差均在士10%范圍內(nèi)，為臨床可接受范圍，且此時(shí)VC的干擾濃度大于《干擾實(shí)驗(yàn)指南》(WS/T 416—2013)中表C規(guī)定的最高病理濃度（114 μmol/L），TB的干擾濃度大于《干擾實(shí)驗(yàn)指南》（WS/T 416—2013）中表C規(guī)定的建議實(shí)驗(yàn)濃度（342 μmol/L）。因此，試劑盒VC抗干擾能力完全能夠滿足臨床的要求。而當(dāng)樣本中TB＞368.4 μmol/L時(shí)，對(duì)尿酸的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照比較相對(duì)偏差會(huì)超出士10%的范圍，說(shuō)明尿酸測(cè)定試劑盒對(duì)膽紅素的抗干擾能力存在一定的局限。因此，為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確真實(shí)，在該項(xiàng)目測(cè)定之前應(yīng)對(duì)黃疸樣本進(jìn)行鑒別，否則得到的尿酸檢測(cè)結(jié)果將不能反映樣本中真實(shí)水平。

維生素C是一種機(jī)體運(yùn)行必需的維生素，具有較強(qiáng)的抗氧化性，能夠通過(guò)減少氧化中間產(chǎn)物的產(chǎn)生及減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生作用機(jī)制減少尿酸的合成，從而對(duì)機(jī)體血清尿酸產(chǎn)生影響。Vc會(huì)對(duì)尿酸測(cè)定中產(chǎn)生的最終產(chǎn)物苯醌亞胺和中間產(chǎn)物過(guò)氧化氫（H2O2）進(jìn)行還原，從而影響尿酸水平，對(duì)最終的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響[6]。

膽紅素對(duì)尿酸測(cè)定的干擾分為光譜干擾和化學(xué)干擾，光譜干擾主要是由于膽紅素被主反應(yīng)中間產(chǎn)物過(guò)氧化氫（H2O2）氧化，在400～540 nm波長(zhǎng)吸光度的下降可掩蓋主反應(yīng)吸光度的增高；而化學(xué)干擾主要是由于高濃度膽紅素破壞了Trinder的中間反應(yīng)，導(dǎo)致有色終反應(yīng)產(chǎn)物減少而使測(cè)定結(jié)果偏低[7]。

當(dāng)發(fā)現(xiàn)尿酸測(cè)定結(jié)果受到維生素C和膽紅素的濃度干擾影響時(shí)，要分析原因，找到解決辦法，可采取稀釋樣本的辦法減少干擾，也可進(jìn)一步嘗試加入抗干擾物質(zhì)，研究開(kāi)發(fā)抗干擾能力更強(qiáng)的尿酸試劑。