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    超聲和剪切聯(lián)合超臨界CO2法制備姜黃素脂質體

    2022-03-29 14:05:36駱靚蕓
    生物化工 2022年1期
    關鍵詞:大豆磷脂脂質體磷脂

    駱靚蕓

    (1.阿澤雷斯國際貿易有限公司,上海 201900;2.上海交通大學 化學化工學院,上海 201100)

    近年來,姜黃素儼然已成為天然藥物研究熱點之一,其具有治療炎癥、緩解關節(jié)疼痛、降低高血壓、抑制腫瘤細胞增殖等藥理活性[1]。但是姜黃素本身水溶性差,光照下易分解,在中性或堿性條件下易降解,在人體中容易被快速代謝而失去活性,導致其生物利用度極低[2]。針對其應用局限性,學者們研究了各種姜黃素劑型,如乳液、納米顆粒、脂質體等。其中,脂質體具有獨特優(yōu)勢:(1)解決了水溶性差和穩(wěn)定性差等問題;(2)對人體安全無毒,具有生物降解性;(3)具有更好的生物相容性,可以提高姜黃素細胞滲透率;(4)容易在肝臟等部位富集,具有靶向富集效果[3]。超臨界CO2法是一種新型綠色制備脂質體的方法,與傳統(tǒng)制備方法相比,其具有工藝簡單、條件可控、無溶劑殘留等優(yōu)勢[4-7]。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    乙醇,分析純,國藥集團化學試劑有限公司;姜黃素,95%,河南晨光科技有限公司;大豆磷脂,98%,北京美亞斯磷脂技術有限公司;膽固醇,95%,阿達瑪斯試劑(上海)有限公司。

    765PC紫外分光光度計,上海光譜儀器廠;SY1200超聲振蕩儀,上海聲源超聲波儀器;JEM-2100透射式電子顯微鏡,日本電子株式會社;ZS90納米粒度分析儀,英國馬爾文儀器。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 姜黃素標準曲線

    將姜黃素稀釋配制得到2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L和10 mg/L姜黃素梯度溶液,以425 nm處吸光度(A)對姜黃素濃度(W)進行線性回歸,獲得姜黃素標準曲線:A=0.114 2W+0.061 8,R2=0.998 9。

    1.2.2 姜黃素脂質體制備條件優(yōu)化

    1.2.2.1 制備流程

    姜黃、大豆磷脂和膽固醇在研缽中研磨成餅狀,分次加入30 mL的PBS磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.0),繼續(xù)研磨至均勻后加入高壓釜。在剪切、45 ℃條件下,通入超臨界CO2直至設定壓力后開啟超聲,保持超聲和剪切共同處理40 min。依次停止加熱、剪切和超聲,釋放CO2。加入100 mL的PBS磷酸緩沖溶液沖洗釜內壁上的黃色顆粒,超聲和攪拌共同處理40 min,即得姜黃素脂質體溶液。

    1.2.2.2 剪切速度優(yōu)化

    壓力20 MPa,溫度45 ℃,大豆磷脂占總脂質(磷脂和膽固醇總和)質量的83%,姜黃素占總脂質質量的5%,超聲功率45 W,超聲和剪切處理40 min,剪切速度分別設置為1 000 r/min、3 000 r/min、5 000 r/min和 7 000 r/min。

    1.2.2.3 超聲功率優(yōu)化

    壓力20 MPa,溫度45 ℃,大豆磷脂占總脂質質量的83%,姜黃素占總脂質質量的5%,剪切速度5 000 r/min,超聲和剪切處理40 min,超聲功率分別設置為0.0 W、22.5 W、45.0 W和180.0 W。

    1.2.2.4 大豆磷脂添加量優(yōu)化

    壓力20 MPa,溫度45 ℃,姜黃素占總脂質質量的5%,剪切速度5 000 r/min,超聲功率45 W,超聲和剪切處理40 min,磷脂質量分別為總脂質的50%、67%、83%和100%。

    1.2.2.5 姜黃素添加量優(yōu)化

    壓力20 MPa,溫度45 ℃,磷脂添加量占總脂質的83%,剪切速度5 000 r/min,超聲功率45 W,超聲和剪切處理40 min,姜黃素質量分別為總脂質的3%、5%、8%和10%。

    1.2.3 姜黃素脂質體包封率的測定

    將姜黃素脂質體溶液混合均勻后在425 nm處測量吸光度 A1,計算Wz;溶液離心(5 000 r/min,15 min)后取上清液測量吸光度A2,計算W1。包封率(EE)的計算公式如(1)所示:

    1.2.4 姜黃素脂質體粒徑分布

    姜黃素脂質體溶液用去離子水稀釋50倍至清澈透明狀態(tài),在馬爾文粒度儀上測量姜黃素脂質體粒徑和粒徑分布。

    1.2.5 姜黃素脂質體形貌表征

    姜黃素脂質體溶液離心(5 000 r/min,15 min)后取上清液,用4 μm濾膜過濾后滴在300目覆有碳膜的銅網上,待樣品完全干燥,觀察姜黃素脂質體微觀結構。

    1.2.6 姜黃素脂質體體外釋放分析

    PBS緩沖溶液(pH=7)和乙醇以1∶25的體積比混合作為釋放介質,稱取姜黃素溶解于釋放介質制成和姜黃素脂質體相同濃度的溶液,將姜黃素脂質體和姜黃素溶液放入已經預處理過的孔徑0.001 μm濾袋中,夾緊開口后浸入100 mL的釋放介質中,(37±0.5)℃水浴攪拌,分別于 0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、12.0 h和24.0 h取5 mL樣品,取樣后立即補充5 mL空白釋放介質。分別測量各個樣品425 nm下的吸光度,計算其累積釋放率[3]。

    2 結果與分析

    2.1 制備工藝優(yōu)化

    由于姜黃素水溶性極差,通過濕法研磨前處理可以使磷脂分子包裹姜黃素均勻混合。采用高速剪切設備來破壞超臨界CO2和水相之間的界面張力以及水膨脹的大豆磷脂凝聚,磷脂分子在剪切應力作用下形成球形膠束,釋放CO2后形成球形雙層分子層囊泡,將表面張力降低至零。超聲和剪切聯(lián)合作用會使得脂質體顆粒更小,分布更均勻,所以超聲和剪切作用是該方法的關鍵[4]。

    2.1.1 剪切速度

    如圖1所示,隨著剪切速度的提高,姜黃素脂質體包封率顯著升高后變化平緩,粒徑減小。當轉速達到5 000 r/min時,包封率達到最大,為87.45%±0.30%;粒徑為323.00 nm±2.86 nm。因此,選擇5 000 r/min作為最佳的剪切速度參數(shù)。

    圖1 剪切速度對姜黃素脂質體的影響

    2.1.2 超聲功率

    如圖2所示,隨著超聲功率的增加,姜黃素脂質體包封率顯著升高,達到最大值后略有下降;粒徑則先減小后增加。當超聲功率為45 W時,包封率最高,為87.11%±0.21%,此時粒徑為321.50 nm±13.40 nm。過度超聲會引起脂質體融合,導致脂質體泄漏,粒徑變大,分布不均勻[8]。因此,以45 W作為最佳超聲功率。

    圖2 超聲功率對姜黃素脂質體的影響

    2.1.3 大豆磷脂添加量

    如圖3所示,隨著大豆磷脂添加量變大,姜黃素脂質體包封率先升高后降低,粒徑則持續(xù)減小。當大豆磷脂添加量為83%時,包封率最大,為78.82%±0.47%;當大豆磷脂添加量為100%時,脂質體粒徑最小,為165.93 nm±7.98 nm。通常情況下,適量膽固醇的加入可以提高脂質膜的流動性,比單一大豆磷脂組成的雙分子層膜穩(wěn)定性更好[9]。因此,綜合考慮以83%作為大豆磷脂的添加量。

    圖3 大豆磷脂添加量對姜黃素脂質體的影響

    2.1.4 姜黃素添加量

    如圖4所示,隨著姜黃素添加量升高,姜黃素脂質體包封率逐漸下降,粒徑持續(xù)變大。姜黃素含量為3%時,包封率最大,為94.23%±0.22%;粒徑最小,為171.13 nm±13.60 nm。研究證實,姜黃素引入脂質雙分子層結構中會導致結構松弛,使得脂質體穩(wěn)定性變差,脂質體顆粒尺寸增大[10]。因此,綜合考慮以5%作為姜黃素的最佳添加量。

    2.2 姜黃脂質體微觀形貌

    如圖5所示,由超聲和剪切聯(lián)合超臨界CO2法制備得到分布均勻的球形小囊泡,粒徑為200 nm左右,外膜平滑顏色較深,中間內核透明,符合脂質體結構特征。

    2.3 姜黃素脂質體釋放動力學

    如圖6所示,姜黃素在24 h后累計釋放了5.5%,姜黃素脂質體在24 h內持續(xù)釋放,共釋放了53.50%姜黃素,說明姜黃素脂質體在體外具有緩慢釋放、提高溶解度的特點。

    圖6 姜黃素和姜黃素脂質體體外釋放曲線

    3 結論

    本研究中建立了一種新的姜黃素脂質體制備方法,使用超臨界CO2代替有機溶劑制備得到包封率較高的姜黃素脂質體,具有操作簡單、無溶劑殘留、包封率高、粒徑均勻等優(yōu)點,且制備得到的姜黃素脂質體體外釋放率是姜黃素的10倍。其中,剪切速度和超聲強度對產品影響最大,隨著剪切速度的增大和超聲強度增強,姜黃素脂質體包封率顯著增大,顆粒尺寸明顯變?。坏羟兴俣冗^大或超聲強度過強會導致姜黃素脂質體破裂,影響產品質量。

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