巴西菇水提物對高脂大鼠血糖血脂的影響

李新明，張雅君，郭尚，郭瀟飛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院，山西太原 030000）

肥胖在臨床上被認(rèn)為是一種代謝綜合征，主要表現(xiàn)在能量消耗、能量攝入和能量代謝紊亂。長期高脂高糖飲食是肥胖的主要誘因，一些疾?。ㄈ绺哐獕?、高血脂、腎臟疾病等）與肥胖有著緊密的關(guān)系。高脂高糖飲食導(dǎo)致的高脂血癥，是冠心病、心肌梗死、心臟猝死、腦卒中及動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病發(fā)病的潛在危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅著人類、尤其是老年人健康[1-3]。近年來，對天然提取物潛在健康效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)了一系列相關(guān)的生物活性，包括抗氧化[4]、抗高脂血癥[5]和抗肥胖[6]等作用。

巴西菇（Agaricus blazeiMurill）又稱姬松茸，屬于傘菌目蘑菇科蘑菇屬[7]。巴西菇不僅味道鮮美，還具有藥理功效。巴西菇水提物具有許多藥理學(xué)功效，如抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗突變、抗病毒、抗衰老及抗炎癥等，還具有降血糖、降血脂、抗輻射、美容、抗過敏、預(yù)防心腦血管系統(tǒng)疾病及抑制細(xì)胞凋亡等功效[8-10]。

本文主要研究了巴西菇對高脂血癥大鼠血脂、氧化應(yīng)激的影響，通過測定相關(guān)數(shù)據(jù)觀察了其在預(yù)防及治療血脂方面的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西菇，購自太原集市。

1.2 試劑與儀器

TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀，日本東芝公司；AL-204電子分析天平，瑞士METTLER-TOLEDO 公司；SOD試劑盒，E-30266，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；MDA試劑盒，E-30265，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；GSH-Px試劑盒，E-31036，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；NANODrop2000紫外分光光度計(jì)，賽默飛世爾。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巴西菇水提物的制備

采用超聲波輔助水提醇沉法對巴西菇進(jìn)行提取[11]。取干燥巴西菇，去除雜質(zhì)，粉碎，過40目篩。按照固液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水混合攪拌，超聲波功率為400 W，60 ℃中提取50 min，重復(fù)3次。合并提取液，放在4 ℃的冰箱中靜置12 h，上清液用4層紗布過濾后離心。上清液用85 ℃水浴濃縮，濃縮液用Sevag法去除蛋白2次，按6倍量加無水乙醇進(jìn)行沉淀，置于-20 ℃的冰箱中過夜，舍棄上清液收集沉淀，真空冷凍干燥后得到巴西菇水提取物。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制率測定

取80 μL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）于96孔板中，再加入20 μL樣品溶液，100 μL的α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）溶液，并在37 ℃搖床中孵育20 min后，加入50 μL的PNPG（5 mmol/L）溶液，并用酶標(biāo)儀分別于0 min和5 min時(shí)，在405 nm處測定吸光度[12]。抑制率計(jì)算公式為：

式（1）中：A1樣品、A0樣品分別為樣品在 5 min、0 min時(shí)的吸光度；A1對照、A0對照分別為對照在5 min、0 min時(shí)的吸光度。

1.3.3 α-淀粉酶抑制率測定

采取3,5-二硝基水楊酸比色法測定α-淀粉酶的抑制作用[13]。取200 μL樣品溶液于試管中，依次加入128 μL蒸餾水、160 μL的α-淀粉酶（1 U/mL）溶液，在37 ℃搖床中孵育5 min后，加入0.5%淀粉溶液320 μL和200 μL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.8），在37 ℃下反應(yīng)10 min。再從中取出200 μL溶液于試管中，加入100 μL3,5-二硝基水楊酸（DNS）終止液，沸水浴15 min，取出冷卻后加入900 μL蒸餾水，混勻后取出200 μL于96孔板中，在540 nm下測定吸光值。以200 μL樣品的溶劑代替樣品，加入0.5%淀粉溶液288 μL和DNS溶液100 μL作為空白；以200 μL樣品的溶劑代替樣品，加入128 μL的蒸餾水，160 μL的α-淀粉酶（1 U/mL）溶液，100 μL的DNS終止液作為對照。測定吸光值，并按式（2）計(jì)算抑制率。

式（2）中：A1、A2、A3分別為550 nm下樣品管、空白管、對照管的吸光值。

1.3.4 蔗糖酶抑制率測定

試管中加入0.5 mL 2%蔗糖溶液，加入1.0 mL 40 mg/L的樣品溶液到抑制管和抑制對照管中，1.0 mL蒸餾水加入空白管和空白對照管中。之后，將0.5 mL蔗糖酶（20 U/mL）分別加入空白管和抑制管，0.5 mL蒸餾水加入對照管，在37 ℃下水浴10 min。接著加入1.0 mL DNS，5 min沸水浴后再加入10.0 mL蒸餾水。降低至室溫，在550 nm處測定吸光值[14]，并按式（3）計(jì)算抑制率。

式（3）中：A4、A5、A6、A7分別為550 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

1.3.5 高脂大鼠模型建立及藥物處理

實(shí)驗(yàn)SD大鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為基礎(chǔ)對照組、模型對照組、巴西菇水提取物低、中、高劑量組，每天定時(shí)喂食，自由飲水?；A(chǔ)對照組喂食基礎(chǔ)飼料，高脂模型對照組喂食高脂飼料，巴西菇水提取物劑量組按照10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg的低、中、高劑量每天灌胃一次，同時(shí)每天定時(shí)喂食高脂飼料，自由飲水，連續(xù)飼喂40 d。

高脂飼料由1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉和79%基礎(chǔ)飼料組成。

在第41天從鼠股靜脈取血、2 000 r/min離心20 min分離血清。血脂指標(biāo)（TG、TC、LDL-c、和HDL-c）的測定使用全自動(dòng)生化分析儀來檢測。按照FFA試劑盒說明測定FFA水平。附睪脂肪組織的處理參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

1.3.6 肝、腎組織中MDA和抗氧化酶活力的分析

各處理組大鼠進(jìn)行處死，取出肝臟、腎臟來制備組織勻漿，按試劑盒說明書操作過程分別測定肝、腎組織中MDA、SOD、CAT和GSH-Px活力值。

1.3.7 脂肪系數(shù)的分析計(jì)算

式（4）中：m1為睪脂總數(shù)，g；m2為鼠的體重，g。

1.3.8 測定空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)

分別參照空腹血糖、胰島素試劑盒說明書測定空腹血糖和胰島素水平。

按照空腹血糖和胰島素濃度的測定數(shù)據(jù)，通過公式（5）計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（Insulin Sensitive Index，ISI）。

式（5）中：ISI表示胰島素敏感指數(shù)；FBG表示空腹血糖的濃度，mmol/L；INS表示胰島素濃度，mIU/L。

1.3.9 UCP-1及PPAR-γ mRNA的表達(dá)

（1）肝、腎組織的總RNA提取。按照說明書，采用RNA提取試劑盒（離心柱型）來提取總RNA，濃度及純度經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析，不符合標(biāo)準(zhǔn)樣品被去除。

（2）cDNA合成。cDNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成，所有過程按照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積20 μL，每個(gè)體系試樣含2 μL 10×RT緩沖液、1 μg RNA、2 μL 隨機(jī)引物、0.8 μL dNTP、1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min、37 ℃120 min、85 ℃5 min，之后取出樣品，在-20 ℃保存。

（3）PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系（10 μL）為cDNA模 板 2 μL，TaqManRMaster 5 μL，ddH2O 2.5μL、引物0.5 μL（序列見表1）。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 20 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。每個(gè)qPCR重復(fù)3次，以β-actin作為內(nèi)參照基因，目的基因的相對表達(dá)量通過公式2-△△Gt計(jì)算。

表1 各基因引物堿基序列

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西菇水提物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和蔗糖酶的影響

巴西菇水提物對α-葡萄糖苷酶的影響如圖1所示，在一定濃度范圍內(nèi)巴西菇水提物對α-葡萄糖苷酶的活力有明顯的抑制效果，隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)濃度為7 mg/mL時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率為78.9%。

圖1 巴西菇水提物對α-葡萄糖苷酶的影響

巴西菇水提物對α-淀粉酶的影響如圖2所示，在一定濃度范圍內(nèi)巴西菇水提物對α-淀粉酶有較好的抑制，隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)濃度為7 mg/mL時(shí)，α-淀粉酶抑制率為84.92%。

圖2 巴西菇水提物對α-淀粉酶的影響

巴西菇水提物對蔗糖酶的影響如圖3所示，在一定濃度范圍內(nèi)巴西菇水提物對蔗糖酶有顯著的抑制，隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)濃度為7 mg/mL時(shí)，蔗糖酶抑制率為92.17%。

圖3 巴西菇水提物對蔗糖酶的影響

2.2 巴西菇水提物對高脂大鼠血脂和氧化應(yīng)激的影響

如表2所示，高脂膳食（HFD）組大鼠血液中TC、TG、LDL-c和FFA水平較正常膳食組顯著增加HDL-c水平顯著降低，（P＜0.01）。與HFD組比，HFD+巴西菇水提物組大鼠血液中TC、TG和FFA水平含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），HDL-c水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且隨著巴西菇水提物劑量的增加而增加或降低，有明顯的量效關(guān)系。

表2 巴西菇水提物對實(shí)驗(yàn)大鼠血脂水平的影響

如表3所示，HFD組大鼠體重和脂肪系數(shù)較正常膳食組顯著增加（P＜0.01）。與HFD組比，HFD+巴西菇水提物組大鼠體重和脂肪系數(shù)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且隨著巴西菇水提物劑量的增加而增加或降低，有明顯的量效關(guān)系。

表3 巴西菇水提物對實(shí)驗(yàn)大鼠體重、脂肪系數(shù)的影響

由表4數(shù)據(jù)可知，與正常膳食對照組相比，高脂膳食模型組空腹血糖和胰島素水平增加，而胰島素敏感指數(shù)降低，有顯著性差異（P＜0.01）；與高脂膳食模型組相比，HFD+巴西菇水提物組的大鼠空腹血糖和胰島素水平下降，而胰島素敏感指數(shù)增加，具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），而且隨著巴西菇水提物劑量的增加，這一變化越顯著（P＜0.01）。

表4 巴西菇水提物對實(shí)驗(yàn)大鼠血糖、胰島素水平和胰島素敏感指數(shù)的影響

與正常膳食組比，高脂膳食能引起大鼠肝、腎中抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力顯著降低（P＜0.01），MDA水平上升；與HFD組比，巴西菇水提物干預(yù)后，均顯著提高了大鼠肝、腎中SOD、CAT和GSH-Px活力（P＜0.05，P＜0.01），降低了MDA水平，而且這些酶活力增長與藥物劑量的增加而呈正比例關(guān)系（表5，表6）。

表5 巴西菇水提物對實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟抗氧化水平的影響

表6 巴西菇水提物對實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟抗氧化水平的影響

與正常膳食組比，高脂膳食能引起大鼠肝、腎中PPAR-γ mRNA水平顯著上升和UCP-1 mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；與HFD組比，巴西菇水提物干預(yù)后，顯著降低了大鼠肝PPAR-γ mRNA表達(dá)水平、提高了腎中UCP-1 mRNA表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01），見表7。

表7 巴西菇水提物對實(shí)驗(yàn)大鼠肝、腎臟PPAR-γ mRNA和UCP-1 mRNA水平的影響

3 討論

α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶是與血糖代謝有著緊密關(guān)系的3種酶[16]。本體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巴西菇水提物對3種酶均能發(fā)揮良好的抑制效果。

心、腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與脂代謝紊亂有著緊密的關(guān)系，主要的生理生化顯示在血清中TC、TG、LDL-c水平的升高與HDL-c的降低這幾個(gè)方面。許多實(shí)驗(yàn)表明脂代謝紊亂與長期高脂膳食的攝取有關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)通過飼喂大鼠高脂飼料建立高脂血癥動(dòng)物模型，模擬人類高脂膳食導(dǎo)致的脂代謝異常，然后通過巴西菇水提取物飼喂干預(yù)，觀察其對高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠脂代謝紊亂的影響。作為藥食同源的蘑菇，巴西菇顯示出較好的改善高脂血癥的效果[18-19]。在本實(shí)驗(yàn)中，巴西菇水提物可以改善高脂膳食鼠的TG、TC、LDL-c、FFA及HDL-c等血脂指標(biāo)，進(jìn)而改善了血脂紊亂。同時(shí)，巴西菇水提物降低了高脂膳食大鼠空腹血糖和胰島素水平，提高了胰島素敏感指數(shù)。這些都表明巴西菇有著良好的降血糖血脂的功效。

在生物機(jī)理正常的情況下，抗氧化系統(tǒng)處于良好的平衡狀態(tài)，然而，在發(fā)生疾病時(shí)，生物機(jī)體的氧化水平與抗氧化水平間的平衡就會被破壞。大量研究表明，長期的高糖高脂膳食攝取會誘導(dǎo)生物機(jī)體自由基蓄積，造成抗氧化水平的降低，從而誘發(fā)各種疾病[20-21]。SOD、CAT和GSH-Px是生物體內(nèi)清除自由基的重要酶，能有效維護(hù)機(jī)體氧化與抗氧化的平衡。因此，機(jī)體中SOD、CAT和GSH-Px水平的高低與機(jī)體抗氧化的能力成正比。MDA是細(xì)胞膜不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的，是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，MDA水平的變化表現(xiàn)脂質(zhì)過氧化作用的程度，間接顯示出細(xì)胞的受損程度[22-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼高脂膳食的大鼠體內(nèi)抗氧化酶水平降低，巴西菇水提物能顯著增強(qiáng)高脂膳食大鼠肝臟、腎臟中SOD、CAT和GSH-Px活性，降低肝臟、腎臟中MDA含量，提高機(jī)體的抗氧化能力。

脂肪組織中PPAR-γ在脂肪細(xì)胞分化、協(xié)調(diào)脂類代謝相關(guān)基因過程中具有重要作用，PPAR-γ受體的活化可促進(jìn)脂肪組織中脂肪酸的利用[24]。模型組鼠的肝臟PPAR-γ mRNA的相對表達(dá)量較高，這可能與鼠脂肪酸水平較高有關(guān)。PPAR-γ活化使轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟的脂肪酸減少，脂肪合成量降低。與模型組比，巴西菇水提物低、中、高劑量組鼠脂肪組織中PPAR-γ mRNA的相對表達(dá)量下降，表明巴西菇水提物可有效降低高脂鼠肝臟脂肪沉積。這些作用可能與PPAR-γ mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)。

線粒體內(nèi)膜蛋白UCP-1能夠降低線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子濃度差，減低利用質(zhì)子濃度差驅(qū)動(dòng)的氧化磷酸化過程的速度，抑制三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生；UCP-1可作為檢驗(yàn)棕色脂肪存在及功能活躍與否的指標(biāo)[25-26]。外界刺激能促進(jìn)甘油三酯脂肪酶分解甘油三酯釋放出脂肪酸，脂肪酸被轉(zhuǎn)移到線粒體產(chǎn)生熱量或進(jìn)入細(xì)胞核以增加UCP-1的表達(dá)并激活棕色脂肪的活性。本實(shí)驗(yàn)中肥胖大鼠經(jīng)巴西菇水提物干預(yù)后，腎周脂肪組織UCP-1 mRNA表達(dá)明顯增加，這可能是巴西菇水提物的干預(yù)抑制了肥胖大鼠白色脂肪細(xì)胞的成脂，并且保護(hù)了其糖脂代謝平衡。

4 結(jié)論

巴西菇水提物具有降脂、預(yù)防肥胖、改善機(jī)體氧化應(yīng)激的作用。另外，巴西菇水提物改善脂代謝與它對PPAR-γ mRNA和UCP-1 mRNA表達(dá)水平有關(guān)，該作用存在量效關(guān)系，這為巴西菇的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。