納米淡水珍珠粉對成骨細(xì)胞成骨活性的影響

廖 軍 徐 普

珍珠由貝體外套膜中的珍珠囊分泌的珍珠質(zhì)組成，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)與人體骨類似，由95%～99%的結(jié)晶磷酸鹽和1%～5%的有機(jī)基質(zhì)組成，其中結(jié)晶磷酸鹽的主要成分為文石型碳酸鈣[1]。珍珠分海水珍珠和淡水珍珠，海水珍珠由文石及少量方解石、球文石組成，淡水珍珠則完全由文石組成。珍珠中高含量的鈣離子可以促進(jìn)鈣鹽沉積，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，促進(jìn)骨再生，且其含有的水溶性蛋白具有骨誘導(dǎo)作用，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[2,3]。同時(shí)，珍珠的納米化可使鈣離子及水溶性蛋白更易于釋放，并減少珍珠的生物降解時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)研究了納米淡水珍珠粉(nanonized freshwater pearl powder，NFPP)相較于目前研究較成熟的納米羥基磷灰石(nanonized hydroxyapatite，NAHA)對成骨細(xì)胞成骨活性的影響，為其在骨組織工程中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.材料與試劑：微米級淡水珍珠粉(海南京潤珍珠有限公司)，納米羥基磷灰石(上海晶純生化科技股份有限公司)，小鼠成骨細(xì)胞(江陰齊氏生物科技有限公司)，DMEM/F12(美國Gibco公司)，胎牛血清FBS(美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶溶液(美國Sigma公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠ALP 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國Rapidbio公司)，茜素紅(北京索萊寶科技有限公司)。

2.儀器與設(shè)備：立式雙軸納米陶瓷砂磨分散機(jī)(深圳市科力納米工程設(shè)備有限公司)，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，Co-60γ輻照裝置(北京原子高科金輝輻射技術(shù)應(yīng)用有限公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Fisher公司)。

3.無菌NFPP的制備：將微米級淡水珍珠粉以立式雙軸納米陶瓷砂磨分散機(jī)研磨成納米級，然后經(jīng)冷凍干燥及60Co輻照滅菌制備成無菌NFPP。

4.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組為NFPP組，陽性對照組為NAHA組，陰性對照組為空白組。

5.成骨細(xì)胞培養(yǎng)：成骨細(xì)胞以D/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

6.細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組，按細(xì)胞密度5×104個(gè)/毫升接種至培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組將NFPP和NAHA各1ml緩慢加入培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基剛好沒過材料，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)7h后，PBS沖洗3次，將培養(yǎng)皿中的實(shí)驗(yàn)材料沖洗干凈，胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓、分離后加入D/F12培養(yǎng)基終止消化，混勻，吸取10μl細(xì)胞懸液及10μl臺盼藍(lán)混勻后做細(xì)胞計(jì)數(shù)。按下列公式計(jì)算細(xì)胞貼壁率：貼壁率(%)=[(接種細(xì)胞數(shù)-細(xì)胞計(jì)數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)]×100%。

7.CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測：按細(xì)胞密度1×104個(gè)/毫升接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，按實(shí)驗(yàn)分組將NFPP和NAHA各200μl加入到細(xì)胞懸液中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。分別在培養(yǎng)的第3、5、7天取24孔培養(yǎng)板檢測，向各實(shí)驗(yàn)組中加入100μl CCK-8溶液，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育3.5h后每孔吸取100μl于96孔板中，酶標(biāo)儀450nm處測定吸光度(A)值。

8.堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測定：細(xì)胞接種同前。分別在培養(yǎng)后的第3、5、7天取24孔培養(yǎng)板檢測，向各實(shí)驗(yàn)組中加入400μl 1%Triton-100液，常溫下裂解30min后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中。將EP管置于冰上，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎5s，然后將EP管轉(zhuǎn)移至低溫高速離心機(jī)中，12000r/min、4℃離心30min。按小鼠ALP酶聯(lián)免疫吸附試劑盒使用說明于波長450nm處測各孔的A值。

9.茜素紅染色：按細(xì)胞密度1×104個(gè)/毫升接種至培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組將分別盛有NFPP和NAHA的細(xì)胞篩置入培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基剛好沒過材料，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)至第7天時(shí)行茜素紅染色，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30min，蒸餾水沖洗3遍，2%茜素紅溶液染色15min，蒸餾水沖洗3遍后倒置顯微鏡下拍照，以Image-Pro Plus 6.0行礦化面積測定。

結(jié) 果

1.細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組較陽性對照組中的細(xì)胞貼壁率高(36.04%±3.21% vs 27.38%±6.39%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測：如表1、表2所示，各組中成骨細(xì)胞的數(shù)量隨時(shí)間的推移而增加，且在各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量實(shí)驗(yàn)組高于陽性對照組高于陰性對照組。培養(yǎng)第3天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)第5天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與兩個(gè)對照組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表1 CCK-8實(shí)驗(yàn)各組各時(shí)間點(diǎn)所測A值的比較

表2 CCK-8各時(shí)間段A值兩兩比較P值

3.ALP活性測定:各組中ALP活性隨時(shí)間的推移而增加，且在各時(shí)間點(diǎn)ALP活性實(shí)驗(yàn)組高于陽性對照組高于陰性對照組。培養(yǎng)第3天、5天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與兩個(gè)對照組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩個(gè)對照組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)第7天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3、表4。

表3 ALP活性檢測各組各時(shí)間點(diǎn)所測A的比較

表4 ALP活性檢測各時(shí)間段A值兩兩比較P值

4.茜素紅染色:細(xì)胞匯合呈集落生長，細(xì)胞間紅褐色結(jié)節(jié)面積實(shí)驗(yàn)組(45.79%)大于陽性對照組(40.74%)大于陰性對照組(15.54%)，詳見圖1。

圖1 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色(×400)

討 論

自1992年法國科學(xué)家Lopezt等[4]發(fā)現(xiàn)珍珠質(zhì)層具有誘導(dǎo)成骨作用以來，陸續(xù)有研究表明珍珠層具有良好的生物相容性，骨誘導(dǎo)及骨傳導(dǎo)作用。而珍珠層中的蛋白在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及組織礦化中起著重要作用。珍珠與貝殼珍珠層均由珍珠囊分泌的珍珠質(zhì)組成，兩者成分和結(jié)構(gòu)非常相似，均由高于95%的礦物質(zhì)和低于5%的有機(jī)基質(zhì)組成，但珍珠中的有機(jī)質(zhì)含量和蛋白質(zhì)含量均較貝殼珍珠層中的高，故研究者開始研究珍珠的成骨作用。

研究證實(shí)，珍珠粉能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及鈣結(jié)節(jié)的形成，并抑制成骨細(xì)胞的凋亡[5]。與微米級比較，納米級具有更好的生物降解性及促骨組織再生作用[6,7]。但與目前研究較成熟的NAHA比較，NFPP促成骨作用如何尚缺少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對比NFPP與NAHA對成骨細(xì)胞成骨活性的影響，研究其在骨組織工程中的應(yīng)用價(jià)值。

在骨組織缺損的修復(fù)過程中，成骨相關(guān)細(xì)胞在骨缺損區(qū)的定植黏附至關(guān)重要[8]。本研究中實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞貼壁率高于陽性對照組，但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因考慮NFPP及NAHA為納米級粉末狀，其材料本身無定型且無特定孔隙，而研究表明珍珠粉中含有的有機(jī)蛋白具有骨誘導(dǎo)作用，可誘導(dǎo)成骨相關(guān)細(xì)胞的聚集并促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，實(shí)驗(yàn)所得材料對細(xì)胞貼壁的影響考慮主要為有機(jī)蛋白的作用；但材料本身的三維結(jié)構(gòu)及孔隙率也影響著骨缺損區(qū)骨組織再生[9]。當(dāng)骨移植材料植入骨缺損區(qū)后，有兩種成骨方式，即接觸成骨與距離成骨。接觸成骨較距離成骨成骨速度快，在早期骨再生中起著重要作用。在接觸成骨中，成骨細(xì)胞黏附是植入材料與成骨細(xì)胞接觸的第一步，直接影響成骨細(xì)胞在骨移植材料表面的增殖及分化。研究所得兩組間細(xì)胞貼壁率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的可能因素之一為材料不具有特定孔隙率的三維支架結(jié)構(gòu)，后續(xù)研究中需將NFPP制備成具有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的骨移植材料進(jìn)一步測定其對細(xì)胞定制黏附的影響。

當(dāng)成骨相關(guān)細(xì)胞在骨缺損區(qū)遷移定植后，進(jìn)一步增殖分化并分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與組織礦化。本研究結(jié)果表明，NFPP和NAHA均能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化結(jié)節(jié)形成，且NFPP較NAHA能更顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化。成骨細(xì)胞是骨生成的主要細(xì)胞，能分泌多種成骨相關(guān)蛋白，包括骨橋蛋白、膠原蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子及ALP等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成及礦化[10,11]。如骨橋蛋白能促進(jìn)磷酸鈣的沉積及調(diào)控羥基磷灰石晶體的大小和形態(tài)[12,13]。膠原蛋白能促進(jìn)細(xì)胞黏附，為營養(yǎng)物質(zhì)、氧和具有機(jī)械傳導(dǎo)作用的分子提供良好的組織通透性[14,15]。轉(zhuǎn)化生長因子能促進(jìn)未分化間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[16]。其中ALP是成骨細(xì)胞早期分化的特異性標(biāo)志物，其分泌量隨成骨細(xì)胞的分化而增加[17]。

ALP能水解磷酸酯鍵，釋放無機(jī)磷，增加局部組織中磷酸根的濃度從而促進(jìn)磷酸鈣的沉積并延續(xù)鈣化過程，是細(xì)胞外基質(zhì)礦化啟動所必須的，而礦化結(jié)節(jié)的形成標(biāo)志著成骨細(xì)胞的分化成熟，是成骨細(xì)胞功能表達(dá)的主要形態(tài)學(xué)表現(xiàn)[18,19]。骨缺損的修復(fù)是成骨相關(guān)細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞等定植、增殖、分化及礦化的一系列有機(jī)連續(xù)的整體過程。局部組織中成骨細(xì)胞增殖數(shù)及分化程度越好，其分泌的成骨相關(guān)蛋白及ALP表達(dá)越高，則越有利于骨組織再生。本研究中NFPP可促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化，與骨缺損修復(fù)過程基本一致，表明NFPP可能在生物體內(nèi)調(diào)控骨組織再生并起促進(jìn)作用。

綜上所述，NFPP較NAHA能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化結(jié)節(jié)的形成。但目前實(shí)驗(yàn)尚未在蛋白及基因?qū)用鏅z測對比研究，且人體是一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)整體，骨移植材料對骨再生的影響還可能通過機(jī)體的局部環(huán)境和宏觀網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控。同時(shí)，對于骨移植材料，如能具有一定孔隙率及孔隙大小的三維空間結(jié)構(gòu)則更有利于新生骨組織的爬行替及新生血管的長入，為骨組織的血管化提供足夠的空間，并為骨組織再生所需空間起到維持作用。故后續(xù)研究中可進(jìn)一步研究NFPP對成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白及成骨基因表達(dá)的影響，并可將NFPP復(fù)合成具有適當(dāng)孔隙率的三維空間結(jié)構(gòu)的骨移植材料，在動物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證其成骨作用。