同位素內(nèi)標稀釋液質(zhì)法測定嬰幼兒配方乳粉中維生素K1

公丕學，廉貞霞，王艷玲，薛霞，戴琨，劉桂亮，王駿，劉艷明，趙發(fā)

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東省特殊醫(yī)學用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，濟南 250100；2.山東省藥學科學院，濟南 250100；3.方正縣產(chǎn)品質(zhì)量綜合檢驗檢測中心，黑龍江 方正 150800）

0 引 言

維生素K1是一種脂溶性維生素，缺乏時會引起失血[1]，在臨床上被廣泛用于防治獲得性維生素K依賴性凝血因子缺乏癥[2]和新生兒自然出血癥[3-4]。生產(chǎn)嬰幼兒配方乳粉時需要適量添加。

檢測維生素K1的方法有毛細管電泳法[5-6]，分光光度法[7-8]，液相色譜-紫外法[9-12]，液相色譜-柱后衍生熒光法[13-15]。毛細管電泳法、分光光度法靈敏度低，準確度差；液相色譜-紫外法干擾嚴重，定量不準確；液相色譜熒光法流動相中使用二氯甲烷，對儀器損害大。液質(zhì)法檢測速度快，靈敏度高，定性定量準確。

本文采用同位素稀釋內(nèi)標UPLC-MS/MS法對嬰幼兒配方乳粉中維生素K1含量測定進行研究，通過加入內(nèi)標提高了定量準確性，并對樣品前處理、色譜質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，提高了檢測靈敏度、準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantiva超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；配備HESI電離源、BSA822-cw型電子天平，德國Sartorios公司；AB204-S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MS3旋渦混合器，德國IKA公司；SB-800DTD型超聲波清洗器，中國寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機，德國Sigma公司；M illi-Q超純水儀器，美國M illipore公司；45位恒溫氮吹儀，美國Organomation公司；SW 22恒溫水浴振蕩器，德國優(yōu)博萊公司。

維生素K1標準物質(zhì)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；脂肪酶（活力≥700 U/mg），德國sigma公司；甲醇（色譜純）,美國Fisher公司；正己烷（色譜純）,美國Merck公司；無水乙醇、氯化鈉（分析純）,國藥集團化學試劑有限公司；醋酸銨（色譜純），德國Flukar公司；色譜柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm），美國Waters公司；0.22 μm有機微孔濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 標準溶液

1.2.1 維生素K1標準溶液校正

準確稱取維生素K1固體標準物質(zhì)20.0 mg至燒杯中，用正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量，并用正己烷定容至刻度。取200μL至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，配置待校正維生素K1標準溶液，在248 nm下用紫外分光光度計進行校正（具體校正方法見國標[16]）。

1.2.2 標準工作曲線配制

準確稱取1 mg（精確至0.01 mg）維生素K1-D7同位素內(nèi)標，用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L內(nèi)標溶液。準確移取維生素K1校正儲備液，用甲醇配制系列標準工作液質(zhì)量濃度分別為5，10，20，50，100，200，500μg/L；其中每個標準點含維生素K1-D7同位素內(nèi)標質(zhì)量濃度為50μg/L。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

BEH C18色譜柱:100 mm×2.1 mm，1.7μm；流動相:A甲醇，B乙酸銨（含體積分數(shù)0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～4.0 min，A由10%線性變化至90%，保持2.0 min，6.1 min時，A由90%變?yōu)?0%，并保持1.9 min。流速為0.3 mL/min；柱溫為35℃；進樣量為5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式為ESI+；鞘氣流速為13.3 L/min；輔助氣流速為4.0 L/min；電噴霧電壓為3 500 V；離子導管溫度為333℃；氣化溫度為317℃；碰撞氣壓力為0.266 Pa。維生素K1及同位素內(nèi)標的離子對及錐孔電壓、碰撞電壓、駐留時間如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

1.3.3 基質(zhì)效應評價

在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測中，基質(zhì)成分改變噴霧液滴張力和黏度，導致離子化程度不同，對目標物電離效率會產(chǎn)生影響，從而會使定量結(jié)果不準確，需要考察質(zhì)譜方法的基質(zhì)效應，以便選擇合適的定量方式。在經(jīng)過處理后的樣品溶液中加入維生素K1內(nèi)標，通過與維生素K1內(nèi)標標準溶液進行比較，可以通過計算，定量評價目標物的基質(zhì)效應。為考察維生素K1的基質(zhì)效應，可以通過比較同位素內(nèi)標在標準溶液和樣品處理液中響應值獲得。通過基質(zhì)效應計算，即

式中：A為標準溶液中維生素K1內(nèi)標的峰面積；B為樣品處理液中維生素K1內(nèi)標的峰面積。在樣品處理液中加入與標準溶液相同濃度的維生素K1內(nèi)標。如果通過計算基質(zhì)效應約等于0%，說明沒有基質(zhì)效應；如果基質(zhì)效應大于0%，說明出現(xiàn)了離子抑制效應，即基質(zhì)抑制；如果基質(zhì)效應小于0%，說明出現(xiàn)了離子增強效應，即基質(zhì)增強。

1.4 樣品處理程序

1.4.1 酶解樣品

稱取2.50 g乳粉樣品置于50 mL離心管中，加250μL維生素K1內(nèi)標（質(zhì)量濃度為1 mg/L），加入10 mL溫水分散溶解樣品，加入0.6 g脂肪酶，渦旋混勻后，在振蕩器中（37±1）℃下恒溫連續(xù)振蕩6 h，待試樣酶解完全。

1.4.2 提取目標物

取出試樣放置至室溫后，加入10 mL乙醇，渦旋混勻，加1 g碳酸鉀，充分混合均勻后，再加10 mL正己烷振蕩5 min，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min高速離心后，取上層溶液至另一離心管中，再用10 mL正己烷重復振蕩提取一次，合并兩次上層提取液。向其中加入10 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋5 min，充分混勻，靜置分層后，取全部上層溶液至離心管中，氮吹，用移液槍準確加1 m L甲醇，渦旋超聲，復溶后，過有機濾膜，濾液待上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1 酶解條件的優(yōu)化

維生素K1屬于脂溶性維生素，而乳粉中含有大量脂肪，因此維生素K1與乳粉中脂溶性物質(zhì)形成結(jié)合態(tài)，很難被直接提取。通過使用脂肪酶酶解樣品中脂肪使其降解生產(chǎn)不飽和脂肪酸，維生素K1成為游離態(tài)，容易從樣品溶液中提取。考察了不同脂肪酶用量以及酶解時間對樣品的提取效率。脂肪酶用量根據(jù)樣品中脂肪含量不同而有所不同，脂肪酶用量結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過多次實驗，脂肪酶使用量為0.6 g時，提取效率能達到90%以上，滿足實驗要求，低于0.6 g時，提取效率低于80%，說明樣品中脂肪不能被脂肪酶酶解完全，仍然存在結(jié)合態(tài)，導致提取充分，提取效率低。

圖1 脂肪酶用量對提取效率的影響

脂肪酶在降解樣品中脂肪時，需要足夠的反應時間，酶解時間結(jié)果如圖2所示。當酶解時間達到6 h時，提取效率能夠達到90%以上；低于6 h時，提取效率不足80%，可能是因為脂肪酶與脂肪在發(fā)生反應時，至少需要6 h以上才能反應完全。因此最終選擇0.6 g脂肪酶，酶解6 h作為最佳酶解條件。

圖2 酶解時間的優(yōu)化

2.1.2 皂化條件的優(yōu)化

皂化是通過用堿使酶解后的脂肪生成能溶于水相的脂肪酸鹽，因此堿的加入量會影響目標物的提取效率。堿量不足則會導致皂化反應不完全，萃取時乳化嚴重，分層不明顯，部分脂溶性維生素K1可能分散在乳化層中，導致提取效率降低；堿量過多則會和維生素K1反應，提取效率降低，同時導致測定結(jié)果偏低。實驗考察了NaOH溶液和固體K2CO3兩種堿對提取效率的影響，結(jié)果顯示當使用NaOH溶液（濃度為10 mol/L，2 mL）時提取效率低于70%，推測可能是堿過量導致與樣品溶液中維生素K1發(fā)生反應；K2CO3（1 g）提取效率能達到90%，說明堿量適合，因此皂化時選擇加入1 g的K2CO3。

2.1.3 基質(zhì)效應評價結(jié)果分析

嬰幼兒配方乳粉中含有添加的維生素K1，因此使用基質(zhì)加標或外標的方式評價不同樣品的基質(zhì)效應會存在較大差異，評價結(jié)果準確性差，樣品中不含有維生素K1的同位素內(nèi)標，使用同位素內(nèi)標進行基質(zhì)效應評價更能反應方法的準確性和可靠性。在樣品處理液中加入與標準溶液相同濃度的同位素內(nèi)標標準物質(zhì)。如果基質(zhì)效應約等于0%，說明幾乎不存在基質(zhì)效應；如果基質(zhì)效應大于0%，說明樣品中產(chǎn)生了離子抑制效應，即基質(zhì)抑制；如果基質(zhì)效應小于0%，說明樣品中產(chǎn)生了離子增強效應，即基質(zhì)增強。

通過1.3.3基質(zhì)效應計算同位素內(nèi)標在嬰幼兒配方乳粉中的基質(zhì)效應，質(zhì)量濃度為50μg/L維生素K1內(nèi)標基質(zhì)效應在52%～74%，則說明樣品對維生素K1內(nèi)標有較強抑制作用，標準溶液定量樣品含量偏差較大，該定量方式不適合選擇標準溶液外標法。因此選擇定量方式為同位素內(nèi)標法定量，更準確，該方法能夠?qū)θ榉壑芯S生素K1準確定量。

2.1.4 色譜條件的優(yōu)化

色譜使用流動相的酸堿性對目標化合物的離子化效率有影響，也可以改善色譜峰峰形，在本試驗中比較了中性流動相甲醇-水和酸性流動相甲醇（含體積分數(shù)0.1%甲酸）兩種流動相體系。由于實驗中維生素K1采用電噴霧電離正離子模式的檢測，流動相中含有提供質(zhì)子的酸能夠提高維生素K1離子化效率，增強信號強度。在BEH C18色譜柱上分離試樣，流動相甲醇-10 mmol/L乙酸銨（含體積分數(shù)0.1%甲酸）目標物峰形較好，質(zhì)譜信號強度增強，靈敏度提高，因此選取甲醇-10 mmol/L乙酸銨（含體積分數(shù)0.1%甲酸）作為流動相。

2.1.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為100μg/L的維生素K1和維生素K1-D7同位素內(nèi)標標準溶液通過蠕動泵進入質(zhì)譜儀，在ESI+模式下對目標物母離子分別進行掃描，確定目標物的準分子離子峰為[M+H]+，維生素K1及維生素K1-D7的母離子m/z分別為451.426和458.457；調(diào)節(jié)離子源參數(shù)后做子離子掃描，同時對子離子進行碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，選擇離子豐度較高的兩對子離子，其中以豐度相對較高的子離子作為定量離子，豐度相對較低的子離子作為定性離子。維生素K1MRM色譜如圖3所示；維生素K1-D7內(nèi)標標準溶液的MRM色譜如圖4所示。

圖3 維生素K1標準溶液的MRM色譜

圖4 維生素K1內(nèi)標標準溶液的MRM色譜

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍與檢出限

將系列標準工作曲線溶液分別進樣5μL，以定量離子峰面積與同位素內(nèi)標定量離子峰面積比值為縱坐標，以維生素K1標準溶液質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標，繪制標準工作曲線，得出線性回歸方程為y=0.02447x+0.00629，線性相關(guān)系數(shù)0.9998，以信號與噪音比值S/N≥3作為檢出限，計算檢出限為1 ng/g，以信號與噪音比值S/N≥10作為定量限，計算定量限為2 ng/g。

2.2.2 方法回收率和精密度

采用嬰幼兒配方乳粉樣品，進行實驗。分別添加質(zhì)量分數(shù)為10、50和100 ng/g 3個水平，按照步驟1.4進行處理和測定，具體實驗結(jié)果見表2所示。

表2 添加回收率與精密度(n=6) ng/g

由表2可見，維生素K1的回收率在88.0%～102.5%。不同水平加標樣品樣品重復測定6次，測定結(jié)果表明RSD為1.75%～5.26%。結(jié)果表明，該方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

2.2.3 實際樣品測定

使用所建立的方法，對市售25批次嬰幼兒配方乳粉進行檢測，結(jié)果均符合明示值。通過購買美國NIST SRM 1849a嬰兒/成人營養(yǎng)配方標準品（標注值為1.06±0.17μg/g），按照步驟1.4同時進行6批樣品平行處理，測定結(jié)果見表3所示，平均值為1.04μg/g，在0.95～1.12μg/g范圍內(nèi)，RSD為6.02%，所建立的方法測定結(jié)果符合標準質(zhì)控樣品真值。

表3 營養(yǎng)配方標準品測定結(jié)果 μg/g

3 結(jié)論

使用脂肪酶對乳粉樣品酶解，皂化，正己烷提取，飽和氯化鈉水洗，濃縮，內(nèi)標法定量，能夠高效提取樣品中維生素K1，能夠提高方法的靈敏度及準確度。通過對酶解條件進行優(yōu)化，堿種類選擇，并對色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化，建立了檢測嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的同位素內(nèi)標稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。

本方法具有線性范圍寬，檢出限低，靈敏度高，定性、定量準確等優(yōu)勢，維生素K1的加標回收率在88.0%～102.5%，重現(xiàn)性好，適用于嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的定量檢測。本方法能夠為生產(chǎn)企業(yè)和檢驗機構(gòu)檢驗嬰幼兒配方乳粉中維生素K1含量提供技術(shù)支持。