拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ在81例腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

陰魯鑫 徐偉文 許 儒 張 奇 陳 洋

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的顱內(nèi)腫瘤，是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。全球每年有近10萬名新診斷患者[1]。WHO將膠質(zhì)瘤分為4級(jí)，4級(jí)又稱膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，是人類所有類型腫瘤中預(yù)后最差的一種。其高致殘率和病死率嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，威脅人們的生命[2]。在診斷出惡性膠質(zhì)瘤的成年人中，超過2/3的人在診斷后2年內(nèi)死亡[3]。目前人腦膠質(zhì)瘤采用的是手術(shù)切除、輔助放化療和免疫治療的綜合方法[4,5]。由于易侵犯相鄰組織，瘤體常與鄰近組織界限不清，全切難度高，易再發(fā)等特點(diǎn)，腦惡性腫瘤的治療始終是人類醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。因此基因檢測(cè)與治療成為當(dāng)今世界研究膠質(zhì)瘤的熱門話題。研究表明拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TOPⅡ)作為腫瘤標(biāo)志物，與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示其表達(dá)與惡性程度與預(yù)后相關(guān)[6]。本研究采取回顧性分析，研究拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及相關(guān)性，分析其與膠質(zhì)瘤臨床病理因素的相關(guān)性，并探討TOPⅡ在膠質(zhì)瘤中的臨床價(jià)值。

材料與方法

1.材料:收集2015年10月～2017年12月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腦外科膠質(zhì)瘤標(biāo)本81例，其標(biāo)本結(jié)果已經(jīng)由病理科證明。標(biāo)本均為第1次在筆者醫(yī)院行手術(shù)取得。標(biāo)本中男性患者44例，女性患者37例，患者年齡11～74歲，平均年齡為52.65±13.11歲。低惡度膠質(zhì)瘤(WHOⅡ級(jí))28例(34.57%)，包括少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤9例、星形細(xì)胞瘤19例；高惡度膠質(zhì)瘤(Ⅲ～Ⅳ級(jí))53例(65.43%)，包含間變性星形細(xì)胞瘤16例、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤37例。

2.試劑與方法：即用型鼠抗人TOPⅡ單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色劑、EDTA pH 8.0修復(fù)液、PBS緩沖液、二抗均購自羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司。標(biāo)本常規(guī)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，分別行HE及免疫組化Envision法染色，染色步驟按步驟說明書嚴(yán)格進(jìn)行。PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

3.免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師閱片后，取得一致意見得出，且所有指標(biāo)只看腫瘤細(xì)胞，以腫瘤周圍正常腦組織為內(nèi)對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果以細(xì)胞膜、質(zhì)、核中分別存在粗細(xì)一致的棕黃色顆粒為陽性。TOPⅡ陽性為核表達(dá)，每張切片計(jì)數(shù)所有TOPⅡ陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)，為TOPⅡ的百分比，采用染色判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥5%為表達(dá)“+”。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析TOPⅡ在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)差異，TOPⅡ與不同分級(jí)膠質(zhì)瘤的關(guān)聯(lián)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)探討TOPⅡ表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系，影響膠質(zhì)瘤預(yù)后因素用COX回歸分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TOPⅡ在81例不同病理分級(jí)膠質(zhì)瘤中的分布：TOPⅡ在膠質(zhì)瘤組織中染色定位主要于細(xì)胞核(圖1)，81例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)陽性有56例，其表達(dá)率占69.14%。在選取的81例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，TOPⅡ表達(dá)陽性在病理級(jí)別Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)所占比例分別為25.00%、87.50%和94.59%，其表達(dá)陽性率隨著腫瘤病理級(jí)別的增高呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì),χ2檢驗(yàn)分析，TOPⅡ在Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明TOPⅡ表達(dá)與膠質(zhì)瘤分級(jí)有關(guān)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，TOPⅡ表達(dá)在膠質(zhì)瘤病理級(jí)別Ⅱ和Ⅲ級(jí)、Ⅱ和Ⅳ級(jí)之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見表1。

圖1 TOPⅡ在膠質(zhì)瘤中表達(dá)(Envision法，×400)

表1 TOPⅡ表達(dá)與81例腦膠質(zhì)瘤患者各項(xiàng)臨床因素的比較[n(%)]

2.TOPⅡ表達(dá)與81例不同病理分級(jí)膠質(zhì)瘤的關(guān)聯(lián)性：采用Spearman秩相關(guān)分析法分析TOPⅡ表達(dá)與不同病理分級(jí)膠質(zhì)瘤的相關(guān)性，TOPⅡ表達(dá)在81例不同病理分級(jí)腫瘤中呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.000)。

3.TOPⅡ表達(dá)與81例腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的相關(guān)性：TOPⅡ表達(dá)與各項(xiàng)臨床因素之間的關(guān)系，按照年齡、性別、病理分級(jí)、高低病理級(jí)別、術(shù)前KPS評(píng)分、IDH1表達(dá)，進(jìn)行分組分析，分析結(jié)果詳見表1，在所選的81例腦膠質(zhì)瘤患者，年齡>45歲的TOPⅡ陽性表達(dá)率為81.36%，年齡≤45歲陽性表達(dá)率為36.36%；男性患者中陽性表達(dá)率為72.73%，女性患者中陽性表達(dá)率為64.86%；其中28例低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中TOPⅡ陽性表達(dá)7例(25%)，53例高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中陽性表達(dá)49例(92.45%)；62例術(shù)前KPS評(píng)分≥80分患者中TOPⅡ陽性表達(dá)37例(59.68%)，19例術(shù)前KPS評(píng)分<80分患者中陽性表達(dá)19例(100%)；30例IDH1表達(dá)陽性患者中TOPⅡ陽性表達(dá)10例(33.33%)，51例IDH1表達(dá)陰性患者中TOPⅡ陽性表達(dá)46例(90.20%)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析表明，年齡>45歲、高病理分級(jí)、術(shù)前KPS評(píng)分<80分、IDH1陰性表達(dá)者中TOPⅡ陽性表達(dá)率分別高于年齡≤45歲、低病理分級(jí)、術(shù)前KPS評(píng)分≥80分、IDH1陽性表達(dá)者(P<0.05)，而性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.445)。

4.81例腦膠質(zhì)瘤預(yù)后影響因素的COX回歸分析：患者出院后，每隔5個(gè)月對(duì)患者或其家屬進(jìn)行定期隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020年8月。依據(jù)年齡、性別、病理級(jí)別高低、術(shù)前KPS評(píng)分、術(shù)后是否行輔助治療、TOPⅡ表達(dá)、IDH1表達(dá)分組，結(jié)果顯示，病理級(jí)別、術(shù)前KPS評(píng)分、術(shù)后輔助治療、TOPⅡ表達(dá)和IDH1表達(dá)對(duì)81例膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存期限影響較大(P<0.05)，而年齡、性別對(duì)術(shù)后生存期影響較小(P>0.05)，詳見表2。

表2 影響81例膠質(zhì)瘤術(shù)后生存期的COX回顧分析

討 論

膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤類型，惡性膠質(zhì)瘤具有極高的致死性，患者的5年生存率不到10%[7]。膠質(zhì)瘤包括源于星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞或脈絡(luò)叢的腫瘤，其中星形細(xì)胞瘤是最常見的。星形細(xì)胞瘤，起源于星形細(xì)胞，可以是局限性或彌漫性的。局限性星形細(xì)胞瘤包括毛細(xì)胞性星形細(xì)胞瘤、多形性黃色星形細(xì)胞瘤和室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤。彌漫性星形細(xì)胞瘤包括低級(jí)纖維星形細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤、腦膠質(zhì)瘤病和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[8]。膠質(zhì)瘤是成人腦腫瘤中預(yù)后較差的一種[9]。腦膠質(zhì)瘤也是所有兒科實(shí)體瘤中最常見和最致命的。迄今為止，腦部惡性腫瘤的治療始終是人類醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)重大挑戰(zhàn)，這在很大程度上是由于這些癌癥的生物學(xué)特性導(dǎo)致的。然而，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、進(jìn)展、具體侵襲機(jī)制尚不是完全清楚。但有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的發(fā)生、進(jìn)展是一個(gè)極其繁雜的經(jīng)過，涉及多種途徑及因素，其中包含多個(gè)細(xì)胞因子及癌癥基因的共同作用，其中一些具有診斷及影響預(yù)后的作用[10]。近年來，隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的發(fā)展及分子診斷、免疫組化等技術(shù)的興起，有關(guān)腫瘤增殖、診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物逐漸被發(fā)現(xiàn)，如拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ等。

拓?fù)洚悩?gòu)酶是種同源二聚體蛋白，在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)和染色質(zhì)重塑過程中調(diào)節(jié)DNA螺旋的上旋或下旋[11,12]。這些酶通過提供短暫的DNA斷裂來執(zhí)行拓?fù)滢D(zhuǎn)換，通過該斷裂可以解決由于DNA螺旋的展開和重繞而導(dǎo)致的DNA糾纏的獨(dú)特問題[13]。根據(jù)它們是否在DNA中造成瞬時(shí)單鏈或雙鏈斷裂，分為Ⅰ和Ⅱ兩類[14]。目前TOPⅡ在人體細(xì)胞內(nèi)是普遍存在的酶，在許多基本的DNA過程中發(fā)揮重要作用。它們通過在雙螺旋的糖磷酸主鏈上產(chǎn)生短暫的斷裂來消除遺傳物質(zhì)中的結(jié)和纏結(jié)。由于Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶在其催化循環(huán)中產(chǎn)生DNA鏈斷裂是必不可少的，所以它們?cè)诿看纹鹱饔脮r(shí)都有可能產(chǎn)生基因組斷裂。因此，這些酶對(duì)增殖細(xì)胞的生存至關(guān)重要。

根據(jù)研究報(bào)道，TOPⅡ在膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)陽性率不同,隨著病理級(jí)別的升高而升高[15]。研究表明，TOPⅡ表達(dá)與男女性別因素?zé)o關(guān)，與高低病理分級(jí)有關(guān)，在高病理分級(jí)腦癌中的表達(dá)要顯著高于低病理分級(jí)的腦癌，同時(shí)認(rèn)為TOPⅡ可作為人腦膠質(zhì)瘤的增殖指數(shù)[16]。通過檢測(cè)TOPⅡ在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，TOPⅡ的表達(dá)與腦癌病理分級(jí)有關(guān)，提示TOPⅡ能作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤生存的相關(guān)指標(biāo)[6]。本研究結(jié)果表明，男女性別差異對(duì)TOPⅡ表達(dá)影響較小，年齡、病理分級(jí)和術(shù)前KPS評(píng)分對(duì)TOPⅡ表達(dá)影響較大；TOPⅡ在膠質(zhì)瘤組織中陽性表達(dá)率為69.14%，在病理級(jí)別Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)所占比例分別為25.00%、87.50%和94.59%，其表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤惡性程度的升高而升高，在低度與高度惡性組之間的表達(dá)水平也有較大差異；TOPⅡ表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，且與膠質(zhì)瘤預(yù)后有關(guān)，可見TOPⅡ與膠質(zhì)瘤患者病情及預(yù)后呈正相關(guān)，提示TOPⅡ表達(dá)可能通過某種未知的機(jī)制促使膠質(zhì)瘤進(jìn)一步惡性轉(zhuǎn)化，同時(shí)可作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

分析TOPⅡ表達(dá)預(yù)后不良的原因，可能與細(xì)胞增殖活化有關(guān)。通常來說，腫瘤增殖活化與生存有著緊密聯(lián)系，增生能力越強(qiáng)，其病理分級(jí)越高，生存期也越短。TOPⅡ是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞生長必需的，在增殖迅速的腫瘤中活性升高，提示其與腫瘤的增殖能力有關(guān)。研究顯示，TOPⅡ在細(xì)胞周期的S期、G2期、M期、部分G0期和G1期均有表達(dá)，且與Ki-67表達(dá)有較高的關(guān)聯(lián)性，Ki-67作為一種增殖抗原，具有體現(xiàn)腫瘤增殖潛能水平的能力，故認(rèn)為TOPⅡ可作為人腦膠質(zhì)瘤的增殖指數(shù)[17]。此外，有研究指出，TOPⅡ家族通過調(diào)節(jié)靶基因和參與能量代謝介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞缺氧耐受而促進(jìn)靶基因蛋白survivin表達(dá)，進(jìn)而提高腫瘤侵襲性[18]。這與本研究結(jié)果大致相符，然而具體機(jī)制尚需開展深入的基礎(chǔ)研究予以證實(shí)。

綜上所述，TOPⅡ在膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中分布不同，提示與病理分級(jí)及預(yù)后相關(guān)，且TOPⅡ表達(dá)與年齡、病理級(jí)別、術(shù)前KPS評(píng)分和IDH1表達(dá)有關(guān)，因此，臨床可通過檢測(cè)TOPⅡ的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)膠質(zhì)瘤患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的評(píng)估。