貓瘟熱病毒血凝抑制與血清中和抗體滴度關(guān)系研究

張 峻，肖春燕

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，上海 201418；2.成都信息工程大學(xué)物流學(xué)院，四川 成都 610103）

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（FPV，同貓瘟熱病毒）是一種單鏈 DNA病毒，是原細(xì)小病毒屬中食肉動物原細(xì)小病毒中的一種[1]。FPV同犬細(xì)小病毒（CPV）和水貂腸炎病毒均能夠?qū)е录邑埣耙柏堃蚣毙阅c胃炎和骨髓抑制等急性致死癥狀而死亡[2]。FPV可通過貓口腔和鼻腔侵入動物體內(nèi)，對咽喉淋巴等組織造成感染，并通過血液循環(huán)系統(tǒng)致病動物全身[3]，因此血液中是否存在抗FPV抗體對預(yù)防及治療貓瘟熱十分重要。對家貓和野貓接種抗FPV疫苗是預(yù)防此疾病的重要手段。目前我國針對貓泛白細(xì)胞減少癥使用的疫苗多為碩騰三聯(lián)滅活疫苗（妙三多）和英特威三聯(lián)微毒疫苗[4]，接種這類疫苗后可能存在因疫苗自身因素、動物應(yīng)激程度、母源抗體以及人為因素等無法形成抗體導(dǎo)致疫苗接種失敗[5]。因此，我們可以把測量血液抗FPV抗體滴度作為評估FPV感染免疫狀態(tài)的方法。血清中和（SN）實(shí)驗(yàn)是目前血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)較高的一種，因其測得的SN抗體與動物機(jī)體感染保護(hù)能力密切相關(guān)，所以SN特異性病毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)與其他檢測方法相比準(zhǔn)確性最高[6]。因SN實(shí)驗(yàn)成本過高且耗時(shí)過長，目前臨床上多利用血凝抑制（HI）實(shí)驗(yàn)作為SN實(shí)驗(yàn)的簡單替代方法，但是FPV抗體檢測的準(zhǔn)確性低于SN實(shí)驗(yàn)[7]。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，針對抗CPV抗體的HI和SN實(shí)驗(yàn)在抗體滴度數(shù)據(jù)上相關(guān)度較低，但是針對抗FPV抗體的HI和SN實(shí)驗(yàn)在抗體滴度比較上的研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)的主要目的是利用HI實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為FPV保護(hù)性抗體效價(jià)指標(biāo)的準(zhǔn)確性研究。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是通過HI實(shí)驗(yàn)提取抗FPV抗體，將結(jié)果呈現(xiàn)陰性或弱陽性滴度的貓血清進(jìn)行SN實(shí)驗(yàn)，對2種實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)的抗體滴度結(jié)果進(jìn)行比較研究后得出。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣本是2020年3月至2021年3月通過成都市和重慶市兩地寵物醫(yī)院收集到的806只已接種過FPV疫苗（未區(qū)分疫苗品牌）、臨床表現(xiàn)健康的家貓血清樣本。

病料是2020年3月從重慶市寵物醫(yī)院1只因感染貓瘟熱而出現(xiàn)腹瀉癥狀的家貓?bào)w內(nèi)分離并培養(yǎng)出的FPV-Som4菌株。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血凝抑制實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

利用HI實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)方法稍做修改，進(jìn)行抗FPV抗體滴度檢測。將25 mL經(jīng)過豬紅細(xì)胞和高嶺土處理的熱滅活血清樣本，在96孔V型底微孔板中用磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBSS，pH 6.7)以1∶10的比例進(jìn)行2倍稀釋，同時(shí)加入等體積FPV-Som4菌株。1 h后將濃度為0.5%的豬紅細(xì)胞添加到每個(gè)板孔中。再經(jīng)過4℃12 h培養(yǎng)后，得出的抗體滴度即為血凝抑制完全后的最高血清稀釋度。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

因FPV感染的培養(yǎng)細(xì)胞病變作用弱，難以進(jìn)行SN實(shí)驗(yàn)中抗體效價(jià)終值的判斷，所以還需要對HI實(shí)驗(yàn)中各孔感染情況進(jìn)行檢測。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，抗體效價(jià)是利用96孔組織培養(yǎng)微孔板進(jìn)行測定分析的。利用一式4份50 μL體積的樣本血清從1∶10的比例稀釋2倍后，每孔加入100 μL半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）的FPV-Som4菌株。再進(jìn)行1 h培養(yǎng)后將貓腎細(xì)胞加入病毒-血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，將獲得的培養(yǎng)液加入與培養(yǎng)液等體積、濃度為0.5%的豬紅細(xì)胞96孔V型底微孔板中，即可測定抗體效價(jià)。本次實(shí)驗(yàn)測定的抗體效價(jià)為血凝抑制達(dá)50%時(shí)的最高血清稀釋度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 HI實(shí)驗(yàn)及SN實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)

利用HI實(shí)驗(yàn)測定這806份血清樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中有67份（8.3%）樣本未檢測出FPV抗體（測試滴度＜1∶10），15 份樣本 HI抗體滴度為 1∶10，26 份樣本HI抗體滴度為 1∶20，53 份樣本 HI抗體滴度為 1∶40。針對實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性及弱陽性的樣本再次進(jìn)行SN實(shí)驗(yàn)，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示。其中，在HI實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性的67份樣本中有43份 （64.2%）樣本利用SN 實(shí)驗(yàn)測定存在 FPV 抗體（測試滴度＞1∶10）。HI實(shí)驗(yàn)測得的抗體呈陰性的樣本利用SN實(shí)驗(yàn)進(jìn)行再測試后，滴度范圍在＜1∶10至 1∶160之間，計(jì)算出的幾何平均數(shù)（GM）為 1∶20.38。

表1 HI檢測為陰性及弱陽性樣本SN再測試數(shù)據(jù)表

將 HI實(shí)驗(yàn)測得的抗體滴度分別為 1∶10、1∶20及1∶40的所有樣本重新進(jìn)行SN實(shí)驗(yàn)后，測得的SN抗體滴度數(shù)據(jù)分布如圖1所示。其中，SN實(shí)驗(yàn)測得的抗體滴度范圍在 1∶13 至 1∶200 時(shí)幾何平均數(shù)為 1∶67.51，抗體滴度范圍在 1∶80至 1∶650時(shí)幾何平均數(shù)為 1∶273.89，抗體滴度范圍在1∶120至1∶1500時(shí)幾何平均數(shù)為1∶547.51。以往的文獻(xiàn)顯示，利用HI實(shí)驗(yàn)測定抗體滴度的保護(hù)閾值設(shè)定為1∶20是最高的，但是本次研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)存在 52.2%（35/67）HI抗體滴度＜1∶10 的樣本及20%（3/15）HI抗體滴度為1∶10的樣本低于該閾值。

圖1 抗體弱陽性檢測對比圖

3.2 數(shù)據(jù)處理及分析

根據(jù)HI實(shí)驗(yàn)抗體滴度數(shù)據(jù)算出各滴度組中SN實(shí)驗(yàn)抗體滴度倒數(shù)對數(shù)值的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.886±0.774（＜1∶10）、1.836±0.314（1∶10）、1.874±0.180（1∶20）和 1.709±0.159（1∶40），利用平均值及標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算出的變異系數(shù) （CV） 值分別為 41.04%（＜1∶10）、17.10%（1∶10）、9.61%（1∶20）和 9.30%（1∶40）。將 SN 實(shí)驗(yàn)測得的滴度平均值作為X值，對應(yīng)的HI實(shí)驗(yàn)滴度組作為Y值利用皮爾森相關(guān)系數(shù)公式:

經(jīng)公式計(jì)算r結(jié)果為0.747。將整體計(jì)算結(jié)果結(jié)合對應(yīng)變異系數(shù)，各HI實(shí)驗(yàn)測得滴度組分布情況直觀展現(xiàn)如圖2所示。因皮爾森相關(guān)系數(shù)值為0.747，比較接近1，說明2種實(shí)驗(yàn)在抗體效價(jià)之間的相關(guān)性較高。但是根據(jù)變異系數(shù)顯示，當(dāng)利用HI實(shí)驗(yàn)測得的抗體滴度＜1∶10時(shí)，樣本存在一定程度變異（41.04%）。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對近期接種過疫苗的動物個(gè)體進(jìn)行性別、品種和年齡抽樣時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)總體分析結(jié)果有差異。

圖2 滴度組相關(guān)性示意圖

在以往針對CPV的研究中發(fā)現(xiàn)，其中和表位及血凝素位在VP2抗原上處于不同位置[8]，說明利用HI實(shí)驗(yàn)并不一定能夠有效反映出中和能力。目前的研究并未發(fā)現(xiàn)FPV也有這樣的特性，但是因FPV與CPV屬于相同種屬的病毒，其可能具有相似的形態(tài)學(xué)特征。針對本次研究，在進(jìn)行HI實(shí)驗(yàn)及SN實(shí)驗(yàn)時(shí)，抗體滴度的皮爾森相關(guān)系數(shù)值為0.747，證明兩者在抗體效價(jià)間的相關(guān)性較高，但是利用HI實(shí)驗(yàn)測得滴度＜1∶10時(shí)SN實(shí)驗(yàn)抗體滴度的變異系數(shù)較高，顯示兩者間存在一定的不一致。另外，在64.2%的樣本中利用HI實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果為陰性的樣本在經(jīng)過SN實(shí)驗(yàn)后檢測到存在FPV抗體，證明利用HI實(shí)驗(yàn)測試抗體敏感度較SN實(shí)驗(yàn)低，這與之前的相關(guān)研究一致，可能是因?qū)嶒?yàn)本身性質(zhì)及FPV病毒性特性導(dǎo)致的。就目前的文獻(xiàn)來看，少有研究FPV不同疫苗間的反應(yīng)率。但是根據(jù)部分文獻(xiàn)顯示，存在部分動物個(gè)體在16周后定時(shí)接種3次及以上疫苗后利用HI實(shí)驗(yàn)檢測并未發(fā)現(xiàn)FPV抗體，可能因動物個(gè)體或部分品牌疫苗效能不足導(dǎo)致抗體經(jīng)HI實(shí)驗(yàn)測得結(jié)果有差異。因此，針對部分已完成FPV疫苗接種但利用HI實(shí)驗(yàn)無法測得存在抗體的個(gè)體可利用SN實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重新測定，以保證抗體檢測的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究的結(jié)論是利用SN實(shí)驗(yàn)測得的對FPV疫苗效果，尤其是在HI測定抗體滴度結(jié)果為陰性及弱陽性貓中的準(zhǔn)確性優(yōu)于HI實(shí)驗(yàn)測定。

4 結(jié)論與展望

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議用1∶20至1∶40的滴度作為FPV保護(hù)性HI抗體滴度閾值。但就目前現(xiàn)有文獻(xiàn)及相關(guān)研究而言，針對設(shè)定這類閾值的參考基礎(chǔ)尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)對FPV保護(hù)性HI滴度閾值的測量是基于將SN抗體滴度閾值設(shè)定在1∶10至1∶32的實(shí)驗(yàn)感染結(jié)果范圍內(nèi)進(jìn)行的。SN抗體滴度為1∶32是實(shí)驗(yàn)中顯示SN抗體閾值中最高的，即在所有HI抗體滴度為1∶20或更高比例的貓個(gè)體中是最高的。因此，在將HI抗體效價(jià)作為指標(biāo)評價(jià)FPV保護(hù)能力時(shí)，將閾值設(shè)定為1∶20可能是最為合適的。

在本次實(shí)驗(yàn)過程中，為了避免因母源抗體對測試結(jié)果造成影響，在樣本選擇過程中我們均選擇了7月齡以上的貓，因此所有檢測到的抗FPV抗體均是主動免疫的產(chǎn)物。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用HI方法進(jìn)行測試無法檢測到抗體數(shù)量占比較高。因本實(shí)驗(yàn)原理的局限性所致，利用HI測試可能無法檢測到此類病毒感染而產(chǎn)生的抗體，同時(shí)盡管兩種測試間的不一致可能僅是因HI測試的靈敏性低造成的，但是結(jié)果不能排除本實(shí)驗(yàn)中存在一定的動物個(gè)體已經(jīng)感染了FPV，在使用HI測試時(shí)需要考慮這種可能。

因本文的目的是為了比較HI與SN之間的差距，未對不同品牌FPV疫苗性能進(jìn)行評估，因此在未來相關(guān)研究工作中可根據(jù)同一疫苗接種動物進(jìn)行。同時(shí)因CPV與FPV病毒屬性的相似性，也可在未來對CPV進(jìn)行HI準(zhǔn)確性研究。