一種新型抗酸染色陽性對照在病理診斷中的應(yīng)用

陳 昕，王 晨，陳 琦，胡辛蘭，陳小巖

結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的傳染病，近年來其發(fā)病率呈增高趨勢。常規(guī)病理確診結(jié)核病，除了觀察其特征性肉芽腫性病理改變外，還需找到結(jié)核分枝桿菌。病理科常規(guī)開展齊-尼抗酸染色尋找病原菌，由于其染色陽性率低，為確保質(zhì)量控制，必須建立陽性對照，以確保染色結(jié)果的可靠性，然而高質(zhì)量的陽性對照組織不易獲得。筆者嘗試用抗酸桿菌培養(yǎng)物和胸腹水的混合團塊做成細胞蠟塊作為陽性對照，取得良好效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試劑 10%中性福爾馬林，瓊脂，抗酸染色試劑(珠海貝索公司)，7 mL MGIT液體培養(yǎng)管。

1.1.2儀器 BACTEC MGIT 960 System全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)，Ⅱ級生物安全柜，高壓蒸汽滅菌器。恒溫培養(yǎng)箱，德國Hettich臺式常溫/冷凍離心機，日本櫻花全封閉自動脫水機，賽默飛包埋機，萊卡切片機。

1.2 方法

1.2.1陽性對照品制備 本院結(jié)核培養(yǎng)室收集臨床標本，嚴格按檢驗規(guī)程[1]進行TB菌培養(yǎng)操作。結(jié)果判定標準：培養(yǎng)有菌株生長，行抗酸染色，染色陽性則將培養(yǎng)物通過增菌來濃縮集菌，集菌完成后用121 ℃高壓鍋滅菌30 min，1 800 r/min離心10 min棄上清備用。

1.2.2瓊脂的制備 取瓊脂粉1.5 g+50 mL蒸餾水放入燒杯中，置于微波爐直接高火加熱1 min，沸騰后切忌溢出，取出觀察粉末是否完全溶解，如未完全溶解可重復(fù)加熱1 min，直至完全溶解。取出后立即轉(zhuǎn)移至大離心管，自然冷卻后冷藏備用。臨用時適量隔熱水浴溶解即可。

1.2.3細胞蠟塊的制備 (1)選擇外觀渾濁、有沉淀的惡性腫瘤胸水或腹水標本，4 ℃靜置30 min，棄上清液，取50 mL底部沉淀樣本注入2～4支離心管中，1 800 r/min離心10 min；棄上清，取沉淀；(2)將各離心管沉淀匯合成1管，用震蕩器震蕩10～20 s混勻，加抗酸培養(yǎng)陽性菌，再次用震蕩器震蕩30 s混勻；(3)加入10%中性福爾馬林固定靜置6～8 h，2 500 r/min離心15 min，棄上清，加溶解后的瓊脂2～5滴(瓊脂量根據(jù)沉淀物多少來定)，震蕩15 s，再次2 500 r/min離心5 min，棄上清液，取出細胞沉渣，用濾紙包埋，放入包埋盒，常規(guī)脫水后包埋備用。

1.2.4抗酸染色 石蠟組織5 μm厚切片，2缸松節(jié)油脫蠟至水，每缸10 min，滴加石碳酸復(fù)紅溶液于切片上，室溫染色10～15 min，水洗；瀝干水分，滴加酸性乙醇溶液脫色1～2 min，充分水洗；滴加亞甲基藍溶液染20～30 s，流水沖洗，干燥、透明、封固。

1.2.5結(jié)果判定 在淡藍色背景下，抗酸染色陽性菌呈紅色；其他細菌及細胞呈藍色。400倍鏡下連續(xù)觀察50個視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌者，判為陰性；每400倍視野找及1條抗酸桿菌判為陽性。

2 結(jié)果

鏡下可見抗酸染色陽性菌呈紅色，且菌群分布合理，背景淡藍色且干凈清晰，在中倍鏡下便可觀察到細菌，方便醫(yī)師閱片，并加快對抗酸染色質(zhì)量的評估(圖1)。

圖1 細胞蠟塊抗酸染色陽性

3 討論

結(jié)核性病變的確診依據(jù)是查找結(jié)核分枝桿菌，抗酸染色因其染色操作簡單，特異性好，成本低，至今仍是病理學(xué)診斷結(jié)核病的首選輔助診斷，病理科常規(guī)開展齊-尼抗酸染色尋找病原菌，其原理是在加熱條件下使分枝桿菌與石碳酸復(fù)紅牢固結(jié)合形成復(fù)合物，酸性乙醇處理不易脫色，經(jīng)亞甲基藍復(fù)染后，分枝桿菌依然呈紅色，突顯于藍色背景中。由于其染色陽性率低，僅達20%～40%[2]，為確保染色結(jié)果的準確性和可靠性，必須建立陽性對照。然而臨床要獲取高質(zhì)量的抗酸染色陽性對照組織非常困難，2015年方偉建等[3]提出符合抗酸陽性蠟塊的標準為：抗酸桿菌豐富(桿菌量>10個/HPF)，陽性菌分布均勻。但以往我院陽性對照組織常常為小標本類穿刺組織，尤其是肺穿刺標本，組織量小，菌量通常很低，并且分布不均勻，經(jīng)過常規(guī)制片已有損耗，加之后期可能進行免疫組化、特殊染色、分子檢測等，還要保障歸檔蠟塊組織的完整性，即使可以當(dāng)陽性蠟塊使用也是為數(shù)不多，目前結(jié)核病可疑患者日益增多，陽性對照組織已無法滿足日常工作需求，甚至用一張陽性對照來完成一批的待檢組織染色，導(dǎo)致存在染色條件不一致性，降低染色結(jié)果可靠性。抗酸染色的陽性率低，對照片供應(yīng)不足可能也是造成染色陽性率低的因素之一。因此獲取可靠的、來源廣泛的高質(zhì)量抗酸染色陽性對照片顯得尤為重要與迫切。

抗酸染色對診斷結(jié)核性病變具有局限性，因其除了結(jié)核分枝桿菌染色外，其它如牛分枝桿菌、禽分枝桿菌以及麻風(fēng)桿菌等抗酸染色均呈陽性[4]。因此，抗酸染色陽性也不能明確結(jié)核菌感染，還需病理診斷醫(yī)師仔細觀察細菌形態(tài)特征，鑒別分枝狀菌的形狀以及組織細胞的特點，如上皮樣組織細胞或泡沫細胞等鑒別，通過結(jié)合臨床病理診斷提高診斷的準確性與精確性[5]。高質(zhì)量的抗酸染色對病理診斷尤為重要，而陽性對照則是確保高質(zhì)量抗酸染色的基礎(chǔ)。

筆者為了解決抗酸染色的陽性對照問題，經(jīng)過反復(fù)多次試驗，利用惡性胸腹水和瓊脂作為黏附基質(zhì)從而制作抗酸桿菌陽性對照，取得較好的效果，這與2020年葉恩如等[6]報道的試驗不同，他們將蛋清作為細胞基質(zhì)來制作陽性對照，優(yōu)點在于蛋清易得，缺點在于需要另外購買，且易污染。而本方法具有以下優(yōu)點：(1)直接利用細胞室現(xiàn)有的惡性胸腹水，而且此類標本大多為滲出液，蛋白定量高，密度大，細胞往往黏附成團，比單純使用瓊脂作為細胞黏附基質(zhì)制作細胞塊，在菌體分布上，菌體包裹的更均勻，不松散，效果更佳。(2)我院有專門的結(jié)核菌培養(yǎng)室，有嚴格的生物安全措施，實驗室安全有保障?？顾釛U菌(含MTB和NTM)用BD公司的MGIT960液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，周期短，1～2周即可培養(yǎng)獲得，要獲得大量陽性菌，只要通過延長培養(yǎng)進行增菌即可。濃集菌經(jīng)高壓滅菌后放密封管可以長期備用，為病理科的后續(xù)需求提供有力保障。(3)另外，本實驗中我們配合使用的是惡性胸腔積液或腹水來制作細胞蠟塊。(4)通過反復(fù)多次實驗，調(diào)整瓊脂與胸腹水的比例，制成的細胞蠟塊陽性菌大多分布均勻，菌量豐富，病理醫(yī)師在鏡下也易判斷染色是否成功，減少閱片時間。(5)與以往采用組織蠟塊作為對照不同，組織中富含多種細胞，成分較雜，而細胞蠟塊里細胞成分簡單，且感染陽性比例高，因此鏡下更易識別陽性菌。(6)應(yīng)用此法制作的細胞蠟塊，一次制備可以被分割為多個小塊蠟塊，即可滿足陽性對照的需求，又能節(jié)約染色試劑，值得推廣。當(dāng)然，本實驗仍然有不足之處，如個別分割后的小蠟塊存在菌量分布不均勻的情況，在瓊脂與胸腹水的比例調(diào)整上仍在摸索最佳比例。另外由于細胞蠟塊的陽性菌較多，為了防止可能交叉污染待檢組織，實驗時把陽性質(zhì)控片放在待檢片的右側(cè)，降低操作中污染的風(fēng)險。