人卵丘顆粒細(xì)胞ADAMTS-1、GDF-9表達水平與IVF胚胎學(xué)結(jié)局的相關(guān)性分析

許相洋,黃 煌,林逕蒼，杜冰汝

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 泉州 362000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬人民醫(yī)院病理科,福建 泉州 362000)

體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF)過程中，受精的質(zhì)量以及早期的胚胎質(zhì)量是影響患者妊娠效果的重要因素[1]。Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs，ADAMTS-1)是人卵泡顆粒細(xì)胞及人卵丘顆粒細(xì)胞重要的蛋白水解酶，但以往研究主要集中于動物實驗，人體研究較少[2]。ADAMTS-1可通過對患者的多功能蛋白聚糖、短蛋白聚糖以及聚集蛋白聚糖產(chǎn)生降解作用，造成蛋白聚糖的結(jié)節(jié)，導(dǎo)致卵泡壁破潰[3]。生長分化因子-9(growth differentiation factor-9，GDF-9)是由卵母細(xì)胞分泌，屬于卵源性生長因子，也是卵泡發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。有效分析IVF胚胎學(xué)結(jié)局的影響因素，并給予針對性措施進行干預(yù)，具有十分重要的臨床價值，但目前臨床人卵丘顆粒細(xì)胞ADAMTS-1、GDF-9表達水平與IVF胚胎學(xué)結(jié)局的相關(guān)性仍處在探索階段，本研究主要通過分析人卵丘顆粒細(xì)胞ADAMTS-1、GDF-9表達水平與IVF胚胎學(xué)結(jié)局的相關(guān)性，為臨床不孕癥的診斷以及早期干預(yù)提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

采用前瞻性研究方法，將2017年1月至2021年1月于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬人民醫(yī)院診斷并進行IVF治療的120例不孕癥患者作為觀察組，年齡21～35歲，平均(28.12±2.11)歲，BMI為(24.55±3.43)kg/m2，根據(jù)妊娠結(jié)局將其分為妊娠成功組(75例)和妊娠失敗組(45例)；另選取120例同期進行健康體檢的女性作為對照組，年齡21～36歲，平均(28.09±3.52)歲，BMI為(24.66±1.33)kg/m2。觀察組與對照組患者的年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(LLH20160611)，所有研究對象均簽署知情同意書。

觀察組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次進行IVF治療；②年齡<35歲；③基礎(chǔ)卵泡刺激素<10 IU/L；④竇卵泡數(shù)>5個；⑤獲卵數(shù)>15個。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不宜接受排卵治療；②有高泌乳素血癥；③高雄性激素分泌。

1.2 方法

IVF治療：患者于月經(jīng)后2～4 d注射50～100 mg/d克羅米芬，5 d后采用150 IU/d尿促卵泡素和50 mg/d克羅米芬至扳機日，按照血中促黃體生成素(luteotropic hormone，LH)、卵泡直徑、雌孕激素等水平和狀態(tài)確定干預(yù)時間，當(dāng)有1個卵泡直徑≥18 mm、有2個卵泡直徑≥17 mm或有3個卵泡直徑≥16 mm時，給予曲普瑞林干預(yù)，32～34 h后取卵，依照精液參數(shù)行常規(guī)IVF干預(yù)并進行體外受精，評估胚胎質(zhì)量后進行移植。

采集所有患者的卵泡液，室溫下將患者的卵泡液以2 500 r/min離心10 min，棄去上清液，將細(xì)胞沉積重懸于磷酸緩沖鹽溶液中，使用1∶1的細(xì)胞懸浮液懸浮于Ficoll分離液中，再次以2 500 r/min離心10 min，抽取兩液面之間的顆粒細(xì)胞層，加入5倍體積的磷酸緩沖鹽溶液，再次以2 500 r/min離心20 min，棄去上清液，在1 mL 0.1%透明質(zhì)酸酶中充分震蕩及消化，使用2倍體積的10%胎牛血清終止消化，離心后棄去上清液，參照文獻[4]制備顆粒細(xì)胞。

采用Western blot對以上細(xì)胞液中相關(guān)蛋白水平進行檢測，使用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞放在冰上裂解30 min，充分裂解后，再次以2 500 r/min離心10 min，取上清液，采用SDS-PAGE以120 V恒壓進行電泳，檢測卵泡液中的ADAMTS-1以及GDF-9水平。

1.3 觀察指標(biāo)

比較觀察組和對照組ADAMTS-1、GDF-9表達水平；比較不同IVF胚胎學(xué)結(jié)局患者ADAMTS-1、GDF-9表達水平。聯(lián)合檢測評估不良結(jié)局，計算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值，靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ADAMTS-1、GDF-9表達水平比較

觀察組的ADAMTS-1、GDF-9表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。妊娠成功組的ADAMTS-1、GDF-9表達水平顯著高于妊娠失敗組(P<0.05)，見表2。

表1 觀察組和對照組ADAMTS-1、GDF-9表達水平比較

表2 不同IVF胚胎學(xué)結(jié)局患者的ADAMTS-1、GDF-9表達水平比較

2.2 相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，患者的IVF胚胎學(xué)結(jié)局與ADAMTS-1、GDF-9表達水平呈正相關(guān)，見表3。

表3 相關(guān)性分析

2.3 聯(lián)合檢測效能分析

ADAMTS-1、GDF-9表達水平的聯(lián)合檢測特異度高于單獨檢測，見表4。

表4 聯(lián)合檢測效能分析

2.4 ROC曲線分析

ADAMTS-1、GDF-9表達水平聯(lián)合檢測的AUC顯著高于單獨檢測，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。針對妊娠失敗患者，ADAMTS-1、GDF-9的臨界值分別為0.3及0.15。

表5 ROC曲線分析

3 討論

IVF的關(guān)鍵步驟在于獲取合適的優(yōu)質(zhì)卵子及胚胎，隨著輔助生殖技術(shù)的日益發(fā)展和促排卵方案的日臻成熟，如何根據(jù)卵巢儲備功能選擇合適的促排卵方案成為了臨床醫(yī)生必須面對的關(guān)鍵問題[5]。而在實際的IVF治療中，患者的宮頸機能不全極易造成流產(chǎn)以及早產(chǎn)。所以在對患者的IVF治療中及時對其不良預(yù)后的風(fēng)險進行評估，及早開展干預(yù)，對于患者的妊娠具有積極的意義[6]。

ADAMTS-1主要位于人體的21號染色體中[7]，有研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-1與細(xì)胞外基質(zhì)的生理功能顯著相關(guān)，是機體排卵以及受精過程中的重要關(guān)鍵水解蛋白酶[8]。動物研究結(jié)果顯示，將實驗小鼠的ADAMTS-1基因進行靶向破壞敲除后，小鼠卵巢功能會發(fā)生障礙[9]。目前臨床對于ADAMTS-1的研究僅僅局限在動物研究中，對于人體的研究較少[10]。理論研究認(rèn)為，ADAMTS-1可通過對蛋白聚糖的裂解作用進一步對排卵前卵泡以及卵母細(xì)胞復(fù)合物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與形態(tài)進行調(diào)控[11]。本研究結(jié)果顯示，采用IVT治療的不孕癥患者ADAMTS-1表達水平顯著低于正常人群，妊娠成功患者的ADAMTS-1表達水平顯著高于妊娠失敗患者。妊娠失敗患者卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體在輸卵管運輸時間的延長，進一步抑制了ADAMTS-1的表達，導(dǎo)致ADAMTS-1表達水平明顯下降[12-13]。紀(jì)藝珍等[14]通過對采用IVT治療的患者的ADAMTS-1表達水平進行分析發(fā)現(xiàn)，隨著患者妊娠結(jié)局變差，其ADAMTS-1表達水平呈顯著下降趨勢，本研究結(jié)果與之一致。

GDF-9的異常表達影響著卵巢中卵泡的發(fā)育，體外實驗已經(jīng)證實，GDF-9可造成大量的始基卵泡生長啟動，進一步降低卵泡閉鎖，促進患者卵泡存活以及生長發(fā)育，同時，其通過對患者垂體激素的顯著激活作用，可進一步促進患者顆粒細(xì)胞分泌因子的分泌，進而促進患者的卵泡發(fā)育[15]。在卵巢體細(xì)胞的發(fā)育過程中，GDF-9對于卵巢功能的維持具有顯著作用，同時，其還可通過卵母細(xì)胞的直接作用對卵巢功能進行調(diào)節(jié)。李春燕等[16]通過對患者的GDF-9水平與卵巢功能進行分析發(fā)現(xiàn)，患者的卵巢功能與GDF-9呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，本研究與之互為印證。

本研究對患者的聯(lián)合檢測效能進行比較發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-1、GDF-9對于早期妊娠結(jié)局的預(yù)測具有重要的作用，而通過ROC曲線得到的臨界值對于臨床早期預(yù)測不良妊娠結(jié)局具有重要意義。

綜上所述，人卵丘顆粒細(xì)胞ADAMTS-1、GDF-9表達水平與IVF胚胎學(xué)結(jié)局呈顯著相關(guān)性，可作為臨床診斷的重要依據(jù)。