Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌中BRAF V600E突變的臨床意義

夏 琛，褚志剛

(1.武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院/武漢市第三醫(yī)院病理科，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院/武漢市第三醫(yī)院燒傷科，湖北 武漢 430060)

Marjolin潰瘍是燒傷等因素引起的皮膚慢性潰瘍惡變，發(fā)病率較高，其預(yù)后較非Marjolin潰瘍皮膚腫瘤者差[1]。鱗狀細(xì)胞癌是Marjolin潰瘍最常見的病理類型。BRAF是位于7號(hào)染色體上的致癌基因[2]，BRAF突變90%發(fā)生在 V600E密碼子上，突變后會(huì)引起細(xì)胞分裂和增殖能力增強(qiáng)，其在許多實(shí)體性腫瘤中發(fā)生突變后可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和生存，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。BRAF基因突變?cè)诮Y(jié)腸癌、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌等腫瘤中均有研究[3]。但Marjolin潰瘍中BRAF V600E突變的臨床意義研究尚未見報(bào)道。本研究通過觀察Marjolin潰瘍和皮膚瘢痕中BRAF V600E的突變情況，了解Marjolin潰瘍中BRAF V600E的突變及其臨床意義，以期為進(jìn)一步研究BRAF對(duì)皮膚瘢痕和Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入我院病理科2019年1月至2020年12月收治的60例Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌患者(Marjolin潰瘍組)，其中男31例，女29例；年齡29～70歲，平均(56.93±6.67)歲。同時(shí)納入60例皮膚瘢痕患者(皮膚瘢痕組)，其中男32例，女28例；年齡28～71歲，平均(52.73±9.12)歲。選取進(jìn)行非Marjolin潰瘍皮瓣移植的60例患者(正常皮膚組)作為對(duì)照，其中男30例，女30例；年齡30～64歲，平均(52.47±8.47)歲。各組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Marjolin潰瘍組患者均為長(zhǎng)期皮膚潰瘍惡變?yōu)轺[狀細(xì)胞癌；皮膚瘢痕組患者僅有皮膚瘢痕，無惡性病變；正常皮膚組患者為非Marjolin潰瘍的正常皮膚。排除使用針對(duì)BRAF V600E突變的靶向藥物患者。

1.2 試劑與儀器

鼠抗人的BRAF V600E單克隆一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠的多聚體二抗以及EliVision Plus/HRP免疫組化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自羅氏公司，人類BRAF V600E突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，BX51生物光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，RM2235手動(dòng)式輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)、ASP300S全自動(dòng)組織脫水機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 免疫組化法

將各組標(biāo)本用10%中性福爾馬林浸泡固定，制成石蠟切片，進(jìn)行蘇木素—伊紅(HE)染色并用EliVision Plus/HRP(辣根過氧化物酶)免疫組化法檢測(cè)各組中BRAF V600E蛋白表達(dá)量。將各組的標(biāo)本用4%中性甲醛浸泡固定24 h后進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片，然后進(jìn)行脫蠟、水化、抗原高壓修復(fù)，用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加BRAF V600E一抗(即用型)，37 ℃孵育1 h。PBS沖洗3次，滴加二抗(即用型)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加DAB顯色10 min，復(fù)染、脫水、透明、封片。100倍光學(xué)顯微鏡下觀察BRAF V600E蛋白表達(dá)情況。用已知蛋白表達(dá)陽性的組織切片(購(gòu)自羅氏公司)免疫組化染色結(jié)果作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗的免疫組化染色結(jié)果作為陰性對(duì)照。每張切片的不同區(qū)域選取10個(gè)高倍鏡視野計(jì)算陽性細(xì)胞率。BRAF V600E突變蛋白表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色，陽性細(xì)胞率高于5%且細(xì)胞著色為陽性[3]，陽性細(xì)胞率低于5%或細(xì)胞不著色為陰性。

1.4 熒光定量PCR

使用QIAGEN公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(批號(hào)56404)試劑盒并嚴(yán)格按照該試劑盒說明書要求提取石蠟包埋病理組織或切片的人類基因組DNA；取出BRAF V600E突變檢測(cè)試劑盒中的反應(yīng)混合液和陽性質(zhì)控品，室溫下解凍，上樣，反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.5 BRAF V600E突變與臨床特征的關(guān)系

分析Marjolin潰瘍組患者BRAF V600E突變情況與臨床特征的關(guān)系，包括性別(男、女)、年齡(<40歲、40～60歲、>60歲)、發(fā)病部位(頭頸部、上肢、軀干部和下肢)、腫瘤分化程度(高分化、中分化和低分化)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，組間和組內(nèi)BRAF V600E陽性表達(dá)率比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BRAF V600E的陽性表達(dá)率比較

Marjolin潰瘍組中BRAF V600E陽性表達(dá)34例(56.7%)，陰性表達(dá)26例；皮膚瘢痕組中BRAF V600E陽性表達(dá)4例(6.7%)，陰性表達(dá)56例；正常皮膚組中BRAF V600E均為陰性表達(dá)。Marjolin潰瘍組BRAF V600E陽性表達(dá)率明顯高于皮膚瘢痕組(χ2=34.660，P=0.000)和正常皮膚組(χ2=47.442，P=0.000)，見圖1。

a：正常皮膚組HE染色；b：皮膚瘢痕組HE染色；c：Marjolin潰瘍組HE染色；d：正常皮膚組免疫組化染色(BRAF V600E呈陰性表達(dá))；e：皮膚瘢痕組免疫組化染色(BRAF V600E呈微弱陽性表達(dá))；f：Marjolin潰瘍組免疫組化染色(BRAF V600E呈強(qiáng)陽性表達(dá))

2.2 Marjolin潰瘍組BRAF V600E的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系

Marjolin潰瘍組腫瘤低分化和中分化患者的BRAF V600E陽性表達(dá)率分別為87.5%和73.7%，均高于腫瘤高分化患者(39.4%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.679，5.964，P=0.017、0.015)。Marjolin潰瘍組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者BRAF V600E陽性表達(dá)率為88.9%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(51.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.477,P=0.034)。不同性別、年齡和發(fā)病部位的Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌患者中BRAF V600E陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

2.3 Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌中BRAF V600E的突變情況

熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，Marjolin潰瘍組有31例(51.7%)患者發(fā)生BRAF V600E突變，皮膚瘢痕組和正常皮膚組患者均未檢測(cè)出BRAF V600E突變，見圖2。Marjolin潰瘍組突變率高于皮膚瘢痕組和正常皮膚組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.559，P=0.000)。

表2 Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌BRAF V600E表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 BRAF V600E突變與Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系

Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌低分化和中分化患者的BRAF V600E突變率高于高分化患者(χ2=8.679、9.131,P=0.003、0.004)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者BRAF V600E突變率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(χ2=5.875,P=0.015)。不同性別、年齡及發(fā)病部位的BRAF V600E突變率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

a：陽性樣本檢測(cè)圖；b:陰性樣本檢測(cè)圖；c：陰陽性質(zhì)控圖

表3 BRAF V600E突變與Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

燒傷及各類創(chuàng)傷后容易形成皮膚瘢痕和潰瘍，部分患者傷口長(zhǎng)期不愈合易惡變成瘢痕癌，即Marjolin潰瘍[4]。鱗狀細(xì)胞癌是Marjolin潰瘍最常見的病理類型，占75%～95%[5]，易發(fā)生在下肢或血運(yùn)較差的區(qū)域，病程較長(zhǎng)，比非Marjolin潰瘍引起的鱗狀細(xì)胞癌更易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6]。目前Marjolin潰瘍的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Marjolin潰瘍中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和CD34表達(dá)增高，尤其二者在癌變區(qū)組織的表達(dá)較周圍組織明顯增高，且EGFR表達(dá)與CD34表達(dá)呈正相關(guān)[7]。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，可與表皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)的激酶磷酸化，激活下游的信號(hào)通路RAS-RAF-MAPK，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及血管生成[8]。RAS是RAF的上游激活蛋白，通過與三磷酸鳥苷結(jié)合而呈活化狀態(tài)，進(jìn)而激活RAF蛋白，使MEK磷酸化并激活ERK[9]；而BRAF是RAS-RAF-MAPK信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)位點(diǎn)[10]，目前RAF和RAS基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌、甲狀腺癌和肺非小細(xì)胞癌中均有發(fā)現(xiàn)，患者使用抗EGFR和BRAF抑制劑治療可從中獲益[11]。BRAF基因突變主要有兩種類型，一種在第11號(hào)外顯子的甘氨酸環(huán)突變；另一種是第15號(hào)外顯子V600E密碼子上的纈氨酸被谷氨酸取代[12]。使用BRAF V600E抗體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)該位點(diǎn)的突變是比較簡(jiǎn)便、可靠的初篩方法[13]。BRAF V600E在許多惡性腫瘤中有突變，且其突變率和各種腫瘤的臨床特征相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，頭頸部、食管和肺等鱗狀細(xì)胞癌中均有BRAF突變[2]。本研究推測(cè)，Marjolin潰瘍中可能存在BRAF V600E突變，故通過觀察Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌患者不同臨床特征的BRAF V600E表達(dá)情況，以期明確Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌中BRAF V600E突變的臨床意義。

BRAF V600E在甲狀腺乳頭狀癌中的突變率為32%～65%[14]，在惡性黑色素瘤中的突變率為41%[15]，在腸癌中的突變率為4%～20%[16]；在非小細(xì)胞肺癌中的突變率為1%～2%[17]。本研究中Marjolin潰瘍組患者BRAF V600E的突變率為51.7%，明顯高于皮膚瘢痕組和正常皮膚組，提示Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌中存在BRAF V600E突變，并且BRAF V600E突變可能是Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制之一。

本研究中，不同分化程度的Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌BRAF V600E的突變率有顯著差異，低分化和中分化鱗狀細(xì)胞癌陽性表達(dá)率高于高分化鱗狀細(xì)胞癌，表明Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌分化程度低則BRAF V600E的突變率高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌患者BRAF V600E突變率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，表明Marjolin潰瘍BRAF V600E的突變可能與其侵襲有關(guān)。在許多惡性腫瘤中BRAF V600E突變與臨床特征的相關(guān)性各有不同，惡性黑色素瘤中BRAF V600E突變與腫瘤的發(fā)生部位有關(guān)[18]；結(jié)腸癌左半結(jié)腸及右半結(jié)腸BRAF V600E的突變率有差異，但與性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)[19]；甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E突變與年齡、病灶數(shù)量、病灶部位以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌患者BRAF V600E突變與性別、年齡和發(fā)病部位無關(guān)。Marjolin潰瘍BRAF V600E的突變與其惡性程度有關(guān)，推測(cè)BRAF V600E突變是Marjolin潰瘍預(yù)后不良的影響因素，尚待進(jìn)一步研究。

綜上，Marjolin潰瘍中BRAF V600E的突變率高于皮膚瘢痕及正常皮膚，并且其突變與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，BRAF V600E可作為評(píng)估Marjolin潰瘍鱗狀細(xì)胞癌惡性程度的指標(biāo)，可為Marjolin潰瘍的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。