豫北地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因型及四種二線藥物耐藥性分布的分析

朱增紅 張會強 屠永凱 葉鵬 趙順現(xiàn) 宋慶芳 王紅民

世界衛(wèi)生組織(WHO)全球結(jié)核病報告證實每年新發(fā)耐藥性結(jié)核病人數(shù)達56萬，而我國是公認結(jié)核病特別是耐多藥結(jié)核病高負擔國家[1]。近年來隨著耐多藥結(jié)核菌株感染比例增加，二線抗結(jié)核藥物獲得大量使用，而這進一步導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)菌株對于此類抗結(jié)核藥物耐藥形成[2]。目前研究認為東亞地區(qū)MTB基因型以北京型為主，該型菌株流行傳播往往與一線抗結(jié)核藥物耐藥性形成無關(guān)[3]；有學(xué)者報道認為北京型MTB菌株基因突變率更高、較易出現(xiàn)異煙肼、利福平、鏈霉素及乙胺丁醇耐藥，治療失敗風險亦顯著提高[4]。但亦有不同觀點認為北京型MTB菌株異煙肼耐藥比例較其他型更低[5]。本次研究納入豫北地區(qū)(安陽、鶴壁、濮陽、新鄉(xiāng)、焦作等五地區(qū))2019年收治肺結(jié)核患者痰涂片檢出MTB菌株共2280株，均行MTB基因型鑒定，分析納入患者一般資料和風險因素，目的在于探討豫北地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因型及四種復(fù)治藥物耐藥性分布，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、一般資料

本次回顧性納入豫北地區(qū)2019年收治肺結(jié)核痰涂片陽性培養(yǎng)標本中MTB菌株共3920株，完成基因分型鑒定和藥敏試驗檢查分別為2910株、2716株，兩者同時擁有者2296株，剔除資料重復(fù)菌株16株，最終納入2280株進行研究。納入標準：①在豫北地區(qū)確診肺結(jié)核；②痰涂片結(jié)核桿菌陽性；③年齡≥18歲；排除標準：①基因分型結(jié)果不完整；②藥敏試驗結(jié)果不完整；③MTB分離失敗。

二 、方法

1 基因分型：采用間隔區(qū)寡核苷酸法完成基因分型，由培養(yǎng)細菌提取基因組DNA，依據(jù)直接重復(fù)位點完成基因型識別；采用DRa和DRb引物完成全部菌株直接重復(fù)區(qū)擴增；將擴增產(chǎn)物和含間隔區(qū)寡核苷酸探針生物素C膜進行雜交，通過化學(xué)發(fā)光法完成雜交信號檢測；檢測結(jié)果對比SpolDB4數(shù)據(jù)庫。

2 藥敏試驗：藥敏試驗根據(jù)嚴格依據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)流程及操作標準完成[6]，采用微孔板法完成分枝桿菌藥敏試驗，以H37Rv株為對照，二線抗結(jié)核藥物種類包括左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素及對氨基水楊酸，含藥培養(yǎng)基中濃度分別為2 mg/L，30 mg/L，2 mg/L，40 mg/L；如樣本菌株與對照菌株相比生長速度>1%時則判定為耐藥；其中耐多藥判定標準為患者至少對異煙肼和利福平同時耐藥。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

選擇SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以%表示；采用Cox比例風險模型計算HR(95%CI)；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料和風險因素分析

2280株MTB菌株中北京和非北京型MTB菌株分別為1882株，398株；Cox比例風險模型分析以基因型情況作為因變量，一般資料指標作為自變量，分析結(jié)果顯示北京和非北京型MTB中，性別、≥65歲比例及戶籍情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 一般資料和風險因素分析

二、MTB基因型與二線抗結(jié)核治療耐藥性間相關(guān)性分析

北京和非北京型MTB菌株中無耐藥和耐多藥比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；北京型MTB菌株耐左氧氟沙星、耐阿米卡星、耐卷曲霉素及耐對氨基水楊酸比例均顯著低于非北京型MTB菌株(P<0.05)(見表2)。

表2 MTB基因型與二線抗結(jié)核治療耐藥性間相關(guān)性分析

討 論

目前研究證實國內(nèi)流行MTB菌株基因型以北京型為主；深入細致了解MTB菌株分子流行病學(xué)特點對于防治結(jié)核病具有重要意義。本次研究納入2280株MTB菌株中，北京和非北京型MTB菌株分別為1882株、398株；其中北京和非北京型MTB中性別、≥65歲比例及戶籍情況比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示豫北地區(qū)流行MTB基因型主要為北京型，且男性、中青年及流動人口中比例更高，與以往報道結(jié)果相符[7]。男性較女性社交更為廣泛頻繁，流動人口所處居住環(huán)境，因人口密度高、擁擠等因素導(dǎo)致北京型更易出現(xiàn)傳播[8]。

以往報道MTB菌株基因型中北京型流行與耐藥性關(guān)系多集中在一線抗結(jié)核藥物間，而對于二線抗結(jié)核藥物耐藥性關(guān)注相對較少。本次研究針對豫北地區(qū)MTB菌種中北京型流行情況及與二線抗結(jié)核藥物耐藥性間關(guān)系，進行分析，結(jié)果顯示北京型MTB菌株耐左氧氟沙星、耐阿米卡星、耐卷曲霉素及耐對氨基水楊酸比例均顯著低于非北京型MTB菌株(P<0.05)，表明豫北地區(qū)北京型MTB流行并未導(dǎo)致二線抗結(jié)核藥物耐藥性增強。但既往研究認為[9]，北京型與非北京型MTB菌株間氧氟沙星耐藥比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，同時rrs基因A1401G替換比例亦接近。已有研究顯示[10]，rrs基因A1401G替換是導(dǎo)致MTB菌株抗阿米卡星形成最常見突變。本次研究顯示北京型MTB菌株對于阿米卡星耐藥比例更低，證實其他基因表達差異，可能亦在其中發(fā)揮著重要作用。筆者查閱文獻注意到不同地區(qū)MTB基因型差異對阿米卡星耐藥性影響研究結(jié)果明顯差異，這可能與各個地區(qū)間存在不同亞系和個別菌株分類有關(guān)，仍有待后續(xù)研究進一步確證。

本次研究結(jié)果中，北京和非北京型MTB菌株中耐多藥比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示豫北地區(qū)耐多藥結(jié)核發(fā)生與MTB菌株基因型無關(guān)，與早期報道結(jié)果相符[11]。但亦有多項研究認為耐多藥菌株流行與MTB北京型密切相關(guān)[12-13]；以上研究進一步證實不同地區(qū)不同菌株間亞型，可能導(dǎo)致最終結(jié)論受影響。

盡管MTB菌株中北京型在我國流行最為廣泛，但各個地區(qū)間亦存在明顯亞系和個別菌株分類差異，從而導(dǎo)致耐藥性特點存在差異[14]。部分學(xué)者研究認為不同時期北京型菌株間存在明顯多態(tài)性特征差異，其中目前基因型菌株與毒力相關(guān)基因多態(tài)性突變更為普遍；此外不同地區(qū)北京型亞型和亞系差異，亦可干擾MTB治療藥物耐藥性[15]。

本次研究僅初步探討MTB菌株北京型與二線抗結(jié)核藥物耐藥性間關(guān)系，缺乏更為深入明確分子層面機制?，F(xiàn)有研究認為MTB菌株北京型蛋白質(zhì)和糖脂代謝，存在自身特征，推測以上改變可能影響自身耐藥性及傳播能力[16]。

綜上所述，豫北地區(qū)MTB菌株以北京型為主，且男性和非本市戶籍人口更為常見；同時非北京型菌株更易出現(xiàn)左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素及對氨基水楊酸耐藥。