• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-17-5p在肺結(jié)核患者外周血中表達(dá)變化及臨床意義

    2022-03-29 12:12:20湯志森王德志
    臨床肺科雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:活動(dòng)性結(jié)核外周血

    湯志森 王德志

    肺結(jié)核是臨床常見的慢性傳染性疾病,主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起,是引起人類死亡率升高的主要傳染病之一[1]。在世界范圍內(nèi),每年大約有1000萬(wàn)例以上的肺結(jié)核新發(fā)病例及140萬(wàn)例以上的肺結(jié)核死亡病例,在國(guó)內(nèi)每年死亡人數(shù)達(dá)12萬(wàn),嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),部分病人感染結(jié)核分枝桿菌后并非立即發(fā)病,直到機(jī)體免疫力下降或變態(tài)反應(yīng)增強(qiáng)后,才表現(xiàn)出肺結(jié)核癥狀[4]。而數(shù)據(jù)顯示,國(guó)內(nèi)有近一半的人感染結(jié)核分枝桿菌,及時(shí)診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性并及時(shí)治療具有重要意義[5]。目前肺結(jié)核臨床診斷方法有細(xì)胞因子檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、抗原檢測(cè)等,但因耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)樣品要求高及可能出現(xiàn)假陰性等缺點(diǎn),難以準(zhǔn)確診斷肺結(jié)核病情從而延誤治療。因此,尋找與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)的基因,快速準(zhǔn)確的判斷肺結(jié)核發(fā)病及其病情,對(duì)肺結(jié)核治療具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種非編碼小RNA分子,長(zhǎng)約20~25個(gè)核苷酸,參與多種疾病生理、病理過程[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miRNA不僅在傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,且在結(jié)核病病人外周血中穩(wěn)定存在,已作為新的生物標(biāo)志物成為結(jié)核病研究熱點(diǎn)[7-8]。目前有研究證實(shí),miR-17-5p在調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9],但在肺結(jié)核患者體內(nèi)的表達(dá)尚鮮有研究。本研究將檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p水平,并探討其臨床意義。

    資料與方法

    一、一般資料

    選取2017年10月至2019年8月在本院就診的肺結(jié)核患者(肺結(jié)核組)86例作為研究對(duì)象。根據(jù)肺結(jié)核活動(dòng)性,將肺結(jié)核患者分為非活動(dòng)性肺結(jié)核組(33例)和活動(dòng)性肺結(jié)核組(53例)。選取同期進(jìn)行體檢的健康者(對(duì)照組)90例作為對(duì)照,肺結(jié)核組和對(duì)照組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

    納入標(biāo)準(zhǔn):(1)肺結(jié)核及其活動(dòng)性診斷符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肺結(jié)核診斷》及《結(jié)核病分類》[10-11]。(2)臨床資料完整,且受試者依從性高。(3)受試對(duì)象知情同意,并簽署有關(guān)證明文書。

    表1 患者一般資料比較

    排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并臟器損害者。(2)合并惡性腫瘤者。(3)合并全身免疫相關(guān)性疾病者。(4)合并其他肺部疾病者。

    二、試劑與儀器

    RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):EX1882-50T、RE0510-100T)購(gòu)自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司;miScript SYBR Green PCR kit(貨號(hào):218076)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號(hào):SEKH-0047、SEKH-0013)及miR-17-5p、U6引物購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

    Rotor-Gene?Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司;SPECTRAmaxM2e型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

    三、血液采集

    肺結(jié)核患者入院第2日晨起抽取肘部空腹靜脈血,對(duì)照組體檢當(dāng)日抽取肘靜脈血,4℃ 3000 r/min離心10 min,取上層血清,分裝、在-80℃冰箱中保存待用。

    四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定外周血miR-17-5p表達(dá)水平

    將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出,于冰上融化,使用RNA提取試劑盒并按照其說明書抽取總RNA,測(cè)定其濃度、純度、完整性后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照其說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-80℃保存。使用miScript SYBR Green PCR kit并按照其說明書配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。以管家基因U6為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法表示miR-17-5p表達(dá)水平。miR-17-5p上游引物:5′-GCCGCAAAGTGCTTACAGTG-3′,miR-17-5p下游引物:5′-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′;U6上游引物:5′-CAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′,U6下游引物:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

    五、ELISA法檢測(cè)外周血炎癥因子水平

    將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出,于冰上融化,分別使用人TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒,按照其說明書進(jìn)行操作,用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(optical density,OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線,計(jì)算TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

    六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血miR-17-5p表達(dá)水平

    與對(duì)照組相比,肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表2)。

    表2 肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血miR-17-5p表達(dá)水平比較

    二、肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血炎癥因子表達(dá)水平

    與對(duì)照組相比,肺結(jié)核組患者外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表3)。

    表3 肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較

    三、肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與炎癥因子的相關(guān)性

    相關(guān)性分析結(jié)果顯示,肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與TNF-α、IL-6均呈顯著正相關(guān)(r=0.524、0.595,P<0.05)(見圖1)。

    四、活動(dòng)性與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平

    與非活動(dòng)性肺結(jié)核組相比,活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

    表4 活動(dòng)性與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平比較

    五、外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核及其活動(dòng)性的診斷價(jià)值分析

    ROC曲線分析結(jié)果顯示,外周血miR-17-5p表達(dá)水平區(qū)分肺結(jié)核患者與健康者的ROC曲線下面積為0.905(95%CI:0.861~0.949),約登指數(shù)為0.684,當(dāng)診斷閾值為1.365時(shí)敏感度為88.4%,特異性為80.0%,見圖2;外周血miR-17-5p表達(dá)水平區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者的ROC曲線下面積為0.756(95%CI:0.681~0.831),約登指數(shù)為0.397,當(dāng)診斷閾值為1.555時(shí)敏感度為48.8%,特異性為90.9%(見圖3)。

    圖1 肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與TNF-α、IL-6的相關(guān)性分析圖

    圖2 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

    圖3 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核活動(dòng)性的診斷價(jià)值

    討 論

    結(jié)核病是全世界面臨的公共衛(wèi)生問題,是現(xiàn)今人類3大感染性疾病之一,其死亡率位于傳染病榜首。每年均有大量人群感染結(jié)核分枝桿菌,發(fā)展為慢性炎癥疾病,通常以肺結(jié)核病居多。流行病學(xué)顯示,全球肺結(jié)核病人的數(shù)量每年以數(shù)百萬(wàn)的速度增加,防治形勢(shì)仍非常嚴(yán)峻,發(fā)病成為活動(dòng)性肺結(jié)核后可導(dǎo)致死亡率大大增加[12]。因此,及時(shí)診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性具有重要臨床價(jià)值。

    近年來,miRNA已被發(fā)現(xiàn)廣泛參與細(xì)胞各種生物學(xué)行為及各種生理、病理反應(yīng)的調(diào)控,包括微生物感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥等反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),宿主被結(jié)核分枝桿菌感染后,巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體可識(shí)別病原體,引發(fā)炎癥反應(yīng)及多種免疫防御機(jī)制,進(jìn)而清除入侵的結(jié)核分枝桿菌[13]。而在結(jié)核分枝桿菌感染的過程中,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的特異性miRNA,可在肺結(jié)核病人血液中被檢測(cè)到。因此,在結(jié)核患者體內(nèi)差異表達(dá)的miRNA,可能參與巨噬細(xì)胞調(diào)控的炎癥反應(yīng)、免疫防御過程,有潛力成為診斷結(jié)核病及其病情的生物標(biāo)識(shí)。康雪雪等[14]研究表明,hsa-miR-17-5p在哮喘兒童血清中高表達(dá),其機(jī)制可能與炎癥、免疫有關(guān),有望成為診斷哮喘的標(biāo)志物。張?zhí)O等[15]研究表明,丙型肝炎患者血清hsa-miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高,與丙型肝炎病毒感染及致病密切相關(guān),有望成為丙肝患者肝損傷判斷的潛在分子標(biāo)志物。而張帆等[9]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌感染可下調(diào)miR-17-5p表達(dá),而miR-17-5p可通過靶向抑制SIRPα表達(dá),上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α表達(dá),進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌的炎癥反應(yīng)。洪丹彤等[16]從自噬角度亦發(fā)現(xiàn),miR-17-5p在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高,提示miR-17-5p參與肺結(jié)核的發(fā)生過程。肺結(jié)核組患者外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高,同時(shí)肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平呈顯著正相關(guān),提示肺結(jié)核患者體內(nèi)miR-17-5p的表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),并推測(cè)miR-17-5p水平升高可能是機(jī)體的內(nèi)源保護(hù)反應(yīng),可能促進(jìn)TNF-α、IL-6表達(dá),調(diào)控肺結(jié)核患者體內(nèi)炎癥反應(yīng),進(jìn)而清除感染的結(jié)核分枝桿菌。

    由于miRNA在血液等臨床樣本中穩(wěn)定性高,可以快速準(zhǔn)確定量,有望成為反映疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)指標(biāo)。侯新月等[2]研究顯示,miR-24-3p區(qū)分肺結(jié)核患者與健康體檢者的敏感度、特異度分別為86%和90%。本研究使用外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核的敏感度、特異性分別為88.4%、80.0%,提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核具有較高的診斷價(jià)值。肺結(jié)核的活動(dòng)性,關(guān)系到患者的治療措施,及時(shí)診斷肺結(jié)核活動(dòng)性對(duì)肺結(jié)核患者治療至關(guān)重要[17]。本研究結(jié)果顯示,活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平較非活動(dòng)性肺結(jié)核組顯著升高,提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平與肺結(jié)核患者活動(dòng)性密切相關(guān)。侯新月等[2]研究顯示,miR-24-3p區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者的敏感度、特異度分別為53.3%和100%。周冰等[5]研究表明,miR-144區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與健康志愿者的敏感度、特異度分別為96.88%和96.77%。本研究使用外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核患者活動(dòng)性的敏感度、特異性分別為48.8%和90.9%,提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核患者活動(dòng)性的特異性較好,具有一定臨床參考價(jià)值。

    綜上所述,miR-17-5p在肺結(jié)核患者外周血中高表達(dá),在活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中表達(dá)更高,其水平與炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯相關(guān),可用于輔助診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性。

    猜你喜歡
    活動(dòng)性結(jié)核外周血
    金屬活動(dòng)性順序的應(yīng)用
    T-SPOT.TB在活動(dòng)性肺結(jié)核治療效果的監(jiān)測(cè)
    金屬活動(dòng)性應(yīng)用舉例
    一度浪漫的結(jié)核
    特別健康(2018年4期)2018-07-03 00:38:26
    層次分析模型在結(jié)核疾病預(yù)防控制系統(tǒng)中的應(yīng)用
    活動(dòng)性與非活動(dòng)性肺結(jié)核血小板參數(shù)、D-D檢測(cè)的臨床意義
    白血病外周血體外診斷技術(shù)及產(chǎn)品
    中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的中醫(yī)辨治思路
    結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸上皮組織中Gal-9的表達(dá)
    慢性蕁麻疹患者外周血IL-17和IL-23的表達(dá)及臨床意義
    成在线人永久免费视频| 免费少妇av软件| 人妻 亚洲 视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久久久精品精品| 亚洲成人免费电影在线观看| av在线老鸭窝| 十八禁网站免费在线| 精品福利永久在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 手机成人av网站| 波多野结衣av一区二区av| 国产一区二区激情短视频 | 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 国产精品欧美亚洲77777| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 999精品在线视频| 日韩电影二区| 久久人妻熟女aⅴ| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 男女床上黄色一级片免费看| 免费看十八禁软件| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 在线观看免费视频网站a站| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 男女免费视频国产| 久久香蕉激情| 久久久精品免费免费高清| 亚洲久久久国产精品| 热99久久久久精品小说推荐| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 无遮挡黄片免费观看| 国产在线一区二区三区精| 男人舔女人的私密视频| 久久精品国产a三级三级三级| 韩国精品一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 国产在线一区二区三区精| 亚洲成人免费av在线播放| 91成人精品电影| 在线观看人妻少妇| videos熟女内射| 午夜福利乱码中文字幕| 俄罗斯特黄特色一大片| 母亲3免费完整高清在线观看| 成在线人永久免费视频| 香蕉丝袜av| 免费观看av网站的网址| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 午夜视频精品福利| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲伊人色综图| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一个人免费在线观看的高清视频 | 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲成人国产一区在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 午夜免费鲁丝| 国产在线一区二区三区精| 日韩视频一区二区在线观看| 91成年电影在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 丰满少妇做爰视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品偷伦视频观看了| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 秋霞在线观看毛片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产高清视频在线播放一区 | av不卡在线播放| 啦啦啦免费观看视频1| 69av精品久久久久久 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 另类亚洲欧美激情| 香蕉国产在线看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 久久女婷五月综合色啪小说| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 岛国在线观看网站| 欧美97在线视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成年美女黄网站色视频大全免费| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲天堂av无毛| 视频区图区小说| 日韩制服骚丝袜av| 婷婷丁香在线五月| 黑人操中国人逼视频| 好男人电影高清在线观看| 亚洲精品一二三| 国产精品 国内视频| 日韩有码中文字幕| 黄色片一级片一级黄色片| 母亲3免费完整高清在线观看| 91成年电影在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美成人午夜精品| www.自偷自拍.com| 在线观看免费视频网站a站| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲中文日韩欧美视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 91大片在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 丝袜在线中文字幕| 男女免费视频国产| 脱女人内裤的视频| 老熟女久久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久影院123| 欧美 日韩 精品 国产| videosex国产| 亚洲成国产人片在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品国产av在线观看| 久久久久国内视频| 亚洲情色 制服丝袜| 悠悠久久av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产精品偷伦视频观看了| 国精品久久久久久国模美| 乱人伦中国视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产97色在线日韩免费| 秋霞在线观看毛片| 老司机影院毛片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 天天添夜夜摸| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 一级片免费观看大全| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| a级毛片黄视频| 国产一卡二卡三卡精品| 日韩制服骚丝袜av| 一区二区三区激情视频| 国产av精品麻豆| 少妇人妻久久综合中文| 伦理电影免费视频| 亚洲 国产 在线| 五月天丁香电影| 亚洲欧美清纯卡通| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美精品亚洲一区二区| 飞空精品影院首页| av免费在线观看网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 性高湖久久久久久久久免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 人人妻人人澡人人看| 欧美国产精品一级二级三级| av电影中文网址| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲欧美色中文字幕在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产免费福利视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 他把我摸到了高潮在线观看 | 视频区图区小说| 女性被躁到高潮视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久免费观看电影| 在线观看免费高清a一片| 成年动漫av网址| 香蕉国产在线看| 亚洲专区字幕在线| 99re6热这里在线精品视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲精品成人av观看孕妇| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲综合色网址| 性色av一级| 日韩视频一区二区在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 一级,二级,三级黄色视频| av在线播放精品| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品欧美亚洲77777| 91字幕亚洲| 精品福利永久在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 国产又色又爽无遮挡免| 国产不卡av网站在线观看| 一进一出抽搐动态| 动漫黄色视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 99久久综合免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲av成人一区二区三| 日本精品一区二区三区蜜桃| www.熟女人妻精品国产| 日本欧美视频一区| 国产麻豆69| 国产日韩欧美视频二区| 伊人亚洲综合成人网| 国产av国产精品国产| 无遮挡黄片免费观看| 免费看十八禁软件| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美日韩精品网址| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 在线观看人妻少妇| www.999成人在线观看| 飞空精品影院首页| 十八禁网站免费在线| 一区二区三区精品91| 成人影院久久| 97人妻天天添夜夜摸| 国产主播在线观看一区二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美精品av麻豆av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 2018国产大陆天天弄谢| 女性被躁到高潮视频| 久久狼人影院| 超色免费av| 欧美久久黑人一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 曰老女人黄片| 大陆偷拍与自拍| 欧美国产精品一级二级三级| 国产淫语在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 青草久久国产| 午夜福利在线免费观看网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 丝袜在线中文字幕| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品一区二区免费欧美 | 成人免费观看视频高清| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 老司机影院成人| 精品人妻1区二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 成年动漫av网址| 国产国语露脸激情在线看| 91精品伊人久久大香线蕉| 无遮挡黄片免费观看| 国产av又大| 无限看片的www在线观看| 一区福利在线观看| 日韩有码中文字幕| 免费日韩欧美在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品久久蜜臀av无| 大片免费播放器 马上看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产伦人伦偷精品视频| 色视频在线一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 精品免费久久久久久久清纯 | 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品二区激情视频| 99精品久久久久人妻精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产一区二区激情短视频 | 十八禁网站网址无遮挡| 桃花免费在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产欧美日韩一区二区三 | 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲久久久国产精品| 777米奇影视久久| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 2018国产大陆天天弄谢| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲久久久国产精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 男人舔女人的私密视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 男女无遮挡免费网站观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 日日爽夜夜爽网站| tube8黄色片| 欧美在线一区亚洲| xxxhd国产人妻xxx| 极品少妇高潮喷水抽搐| 51午夜福利影视在线观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 人人妻人人澡人人看| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产成人系列免费观看| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲色图综合在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 无限看片的www在线观看| 欧美黑人精品巨大| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 99九九在线精品视频| 精品视频人人做人人爽| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲成人免费电影在线观看| 在线看a的网站| 中文字幕高清在线视频| 免费在线观看完整版高清| 国产熟女午夜一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产亚洲一区二区精品| 亚洲男人天堂网一区| 又大又爽又粗| 久久 成人 亚洲| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久国产一区二区| 国产精品免费视频内射| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 嫩草影视91久久| 久久久国产精品麻豆| 免费av中文字幕在线| 国产成人系列免费观看| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 在线观看人妻少妇| 国产色视频综合| 国产精品99久久99久久久不卡| 五月开心婷婷网| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美在线一区亚洲| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美精品av麻豆av| 欧美在线黄色| 最新在线观看一区二区三区| 自线自在国产av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品久久久精品久久久| 久久av网站| 婷婷丁香在线五月| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 黄频高清免费视频| 亚洲色图综合在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品偷伦视频观看了| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲七黄色美女视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av美国av| 桃花免费在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 午夜福利视频精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 在线看a的网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av在线app专区| 精品福利永久在线观看| 黄片播放在线免费| av在线老鸭窝| 69精品国产乱码久久久| 不卡av一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲avbb在线观看| 国产一级毛片在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 一区二区三区精品91| 国产免费视频播放在线视频| 国产成人系列免费观看| 免费在线观看黄色视频的| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜福利视频在线观看免费| 久久性视频一级片| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 又大又爽又粗| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久 成人 亚洲| 人妻一区二区av| 色综合欧美亚洲国产小说| www.自偷自拍.com| 国产一区二区三区av在线| 91精品国产国语对白视频| 久久亚洲国产成人精品v| 成人三级做爰电影| 日韩中文字幕欧美一区二区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精品第一国产精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美黄色淫秽网站| 激情视频va一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜老司机福利片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜福利乱码中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 成人免费观看视频高清| 欧美国产精品va在线观看不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 黄色 视频免费看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品亚洲成a人片在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 99精品欧美一区二区三区四区| 真人做人爱边吃奶动态| 99国产综合亚洲精品| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲av国产av综合av卡| 男人舔女人的私密视频| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中文字幕精品免费在线观看视频| 免费看十八禁软件| 亚洲专区中文字幕在线| 首页视频小说图片口味搜索| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲国产av新网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲欧美激情在线| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲国产欧美网| 51午夜福利影视在线观看| 国产视频一区二区在线看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 9色porny在线观看| 91成年电影在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲人成电影观看| 十八禁高潮呻吟视频| 多毛熟女@视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| av电影中文网址| 视频在线观看一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品久久蜜臀av无| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频 | 久久精品亚洲av国产电影网| 99国产精品一区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产高清国产精品国产三级| 欧美97在线视频| 欧美黄色淫秽网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 91字幕亚洲| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 中文字幕制服av| 视频在线观看一区二区三区| 我要看黄色一级片免费的| 国产精品av久久久久免费| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 免费高清在线观看日韩| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| av一本久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久久国产精品大桥未久av| 黄片播放在线免费| 91精品三级在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品粉嫩美女一区| 91精品国产国语对白视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 十八禁高潮呻吟视频| av片东京热男人的天堂| 亚洲少妇的诱惑av| 人人妻人人澡人人看| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产成人免费观看mmmm| 波多野结衣av一区二区av| 十分钟在线观看高清视频www| 丁香六月天网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品亚洲成国产av| 精品欧美一区二区三区在线| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲 欧美一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美激情高清一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 久久免费观看电影| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久精品国产亚洲av高清一级| 色播在线永久视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品 国内视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲天堂av无毛| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 最新在线观看一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 制服人妻中文乱码| 国产不卡av网站在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日韩大片免费观看网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 老司机福利观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产成人av教育| 精品人妻1区二区| 人妻久久中文字幕网| 日韩欧美一区视频在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产一卡二卡三卡精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| www.av在线官网国产| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲九九香蕉| 老司机深夜福利视频在线观看 | 中国国产av一级| 国产91精品成人一区二区三区 | 男女无遮挡免费网站观看| 后天国语完整版免费观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品福利观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 97精品久久久久久久久久精品| 成年人黄色毛片网站| 自线自在国产av| 亚洲伊人久久精品综合| 波多野结衣av一区二区av| 精品一区二区三卡| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产高清视频在线播放一区 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 日本av手机在线免费观看| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 人妻 亚洲 视频| 黄片播放在线免费| 免费高清在线观看日韩| 女性被躁到高潮视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 成人国产一区最新在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲第一av免费看| 久久热在线av| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产av一区二区精品久久| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产高清视频在线播放一区 | 午夜福利乱码中文字幕| 丁香六月欧美| 男女免费视频国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日本wwww免费看| 99re6热这里在线精品视频| 欧美激情久久久久久爽电影 |