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    miR-17-5p在肺結(jié)核患者外周血中表達(dá)變化及臨床意義

    2022-03-29 12:12:20湯志森王德志
    臨床肺科雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:活動(dòng)性結(jié)核外周血

    湯志森 王德志

    肺結(jié)核是臨床常見的慢性傳染性疾病,主要由結(jié)核分枝桿菌感染引起,是引起人類死亡率升高的主要傳染病之一[1]。在世界范圍內(nèi),每年大約有1000萬(wàn)例以上的肺結(jié)核新發(fā)病例及140萬(wàn)例以上的肺結(jié)核死亡病例,在國(guó)內(nèi)每年死亡人數(shù)達(dá)12萬(wàn),嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),部分病人感染結(jié)核分枝桿菌后并非立即發(fā)病,直到機(jī)體免疫力下降或變態(tài)反應(yīng)增強(qiáng)后,才表現(xiàn)出肺結(jié)核癥狀[4]。而數(shù)據(jù)顯示,國(guó)內(nèi)有近一半的人感染結(jié)核分枝桿菌,及時(shí)診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性并及時(shí)治療具有重要意義[5]。目前肺結(jié)核臨床診斷方法有細(xì)胞因子檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、抗原檢測(cè)等,但因耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)樣品要求高及可能出現(xiàn)假陰性等缺點(diǎn),難以準(zhǔn)確診斷肺結(jié)核病情從而延誤治療。因此,尋找與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)的基因,快速準(zhǔn)確的判斷肺結(jié)核發(fā)病及其病情,對(duì)肺結(jié)核治療具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種非編碼小RNA分子,長(zhǎng)約20~25個(gè)核苷酸,參與多種疾病生理、病理過程[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miRNA不僅在傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,且在結(jié)核病病人外周血中穩(wěn)定存在,已作為新的生物標(biāo)志物成為結(jié)核病研究熱點(diǎn)[7-8]。目前有研究證實(shí),miR-17-5p在調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9],但在肺結(jié)核患者體內(nèi)的表達(dá)尚鮮有研究。本研究將檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p水平,并探討其臨床意義。

    資料與方法

    一、一般資料

    選取2017年10月至2019年8月在本院就診的肺結(jié)核患者(肺結(jié)核組)86例作為研究對(duì)象。根據(jù)肺結(jié)核活動(dòng)性,將肺結(jié)核患者分為非活動(dòng)性肺結(jié)核組(33例)和活動(dòng)性肺結(jié)核組(53例)。選取同期進(jìn)行體檢的健康者(對(duì)照組)90例作為對(duì)照,肺結(jié)核組和對(duì)照組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

    納入標(biāo)準(zhǔn):(1)肺結(jié)核及其活動(dòng)性診斷符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肺結(jié)核診斷》及《結(jié)核病分類》[10-11]。(2)臨床資料完整,且受試者依從性高。(3)受試對(duì)象知情同意,并簽署有關(guān)證明文書。

    表1 患者一般資料比較

    排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并臟器損害者。(2)合并惡性腫瘤者。(3)合并全身免疫相關(guān)性疾病者。(4)合并其他肺部疾病者。

    二、試劑與儀器

    RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):EX1882-50T、RE0510-100T)購(gòu)自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司;miScript SYBR Green PCR kit(貨號(hào):218076)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號(hào):SEKH-0047、SEKH-0013)及miR-17-5p、U6引物購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

    Rotor-Gene?Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司;SPECTRAmaxM2e型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

    三、血液采集

    肺結(jié)核患者入院第2日晨起抽取肘部空腹靜脈血,對(duì)照組體檢當(dāng)日抽取肘靜脈血,4℃ 3000 r/min離心10 min,取上層血清,分裝、在-80℃冰箱中保存待用。

    四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定外周血miR-17-5p表達(dá)水平

    將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出,于冰上融化,使用RNA提取試劑盒并按照其說明書抽取總RNA,測(cè)定其濃度、純度、完整性后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照其說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-80℃保存。使用miScript SYBR Green PCR kit并按照其說明書配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。以管家基因U6為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法表示miR-17-5p表達(dá)水平。miR-17-5p上游引物:5′-GCCGCAAAGTGCTTACAGTG-3′,miR-17-5p下游引物:5′-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′;U6上游引物:5′-CAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′,U6下游引物:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

    五、ELISA法檢測(cè)外周血炎癥因子水平

    將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出,于冰上融化,分別使用人TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒,按照其說明書進(jìn)行操作,用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(optical density,OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線,計(jì)算TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

    六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血miR-17-5p表達(dá)水平

    與對(duì)照組相比,肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表2)。

    表2 肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血miR-17-5p表達(dá)水平比較

    二、肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血炎癥因子表達(dá)水平

    與對(duì)照組相比,肺結(jié)核組患者外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表3)。

    表3 肺結(jié)核組與對(duì)照組外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較

    三、肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與炎癥因子的相關(guān)性

    相關(guān)性分析結(jié)果顯示,肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與TNF-α、IL-6均呈顯著正相關(guān)(r=0.524、0.595,P<0.05)(見圖1)。

    四、活動(dòng)性與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平

    與非活動(dòng)性肺結(jié)核組相比,活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

    表4 活動(dòng)性與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平比較

    五、外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核及其活動(dòng)性的診斷價(jià)值分析

    ROC曲線分析結(jié)果顯示,外周血miR-17-5p表達(dá)水平區(qū)分肺結(jié)核患者與健康者的ROC曲線下面積為0.905(95%CI:0.861~0.949),約登指數(shù)為0.684,當(dāng)診斷閾值為1.365時(shí)敏感度為88.4%,特異性為80.0%,見圖2;外周血miR-17-5p表達(dá)水平區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者的ROC曲線下面積為0.756(95%CI:0.681~0.831),約登指數(shù)為0.397,當(dāng)診斷閾值為1.555時(shí)敏感度為48.8%,特異性為90.9%(見圖3)。

    圖1 肺結(jié)核患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與TNF-α、IL-6的相關(guān)性分析圖

    圖2 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

    圖3 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核活動(dòng)性的診斷價(jià)值

    討 論

    結(jié)核病是全世界面臨的公共衛(wèi)生問題,是現(xiàn)今人類3大感染性疾病之一,其死亡率位于傳染病榜首。每年均有大量人群感染結(jié)核分枝桿菌,發(fā)展為慢性炎癥疾病,通常以肺結(jié)核病居多。流行病學(xué)顯示,全球肺結(jié)核病人的數(shù)量每年以數(shù)百萬(wàn)的速度增加,防治形勢(shì)仍非常嚴(yán)峻,發(fā)病成為活動(dòng)性肺結(jié)核后可導(dǎo)致死亡率大大增加[12]。因此,及時(shí)診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性具有重要臨床價(jià)值。

    近年來,miRNA已被發(fā)現(xiàn)廣泛參與細(xì)胞各種生物學(xué)行為及各種生理、病理反應(yīng)的調(diào)控,包括微生物感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥等反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),宿主被結(jié)核分枝桿菌感染后,巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體可識(shí)別病原體,引發(fā)炎癥反應(yīng)及多種免疫防御機(jī)制,進(jìn)而清除入侵的結(jié)核分枝桿菌[13]。而在結(jié)核分枝桿菌感染的過程中,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的特異性miRNA,可在肺結(jié)核病人血液中被檢測(cè)到。因此,在結(jié)核患者體內(nèi)差異表達(dá)的miRNA,可能參與巨噬細(xì)胞調(diào)控的炎癥反應(yīng)、免疫防御過程,有潛力成為診斷結(jié)核病及其病情的生物標(biāo)識(shí)。康雪雪等[14]研究表明,hsa-miR-17-5p在哮喘兒童血清中高表達(dá),其機(jī)制可能與炎癥、免疫有關(guān),有望成為診斷哮喘的標(biāo)志物。張?zhí)O等[15]研究表明,丙型肝炎患者血清hsa-miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高,與丙型肝炎病毒感染及致病密切相關(guān),有望成為丙肝患者肝損傷判斷的潛在分子標(biāo)志物。而張帆等[9]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌感染可下調(diào)miR-17-5p表達(dá),而miR-17-5p可通過靶向抑制SIRPα表達(dá),上調(diào)細(xì)胞因子TNF-α表達(dá),進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌的炎癥反應(yīng)。洪丹彤等[16]從自噬角度亦發(fā)現(xiàn),miR-17-5p在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高,提示miR-17-5p參與肺結(jié)核的發(fā)生過程。肺結(jié)核組患者外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高,同時(shí)肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平與外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平呈顯著正相關(guān),提示肺結(jié)核患者體內(nèi)miR-17-5p的表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),并推測(cè)miR-17-5p水平升高可能是機(jī)體的內(nèi)源保護(hù)反應(yīng),可能促進(jìn)TNF-α、IL-6表達(dá),調(diào)控肺結(jié)核患者體內(nèi)炎癥反應(yīng),進(jìn)而清除感染的結(jié)核分枝桿菌。

    由于miRNA在血液等臨床樣本中穩(wěn)定性高,可以快速準(zhǔn)確定量,有望成為反映疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)指標(biāo)。侯新月等[2]研究顯示,miR-24-3p區(qū)分肺結(jié)核患者與健康體檢者的敏感度、特異度分別為86%和90%。本研究使用外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核的敏感度、特異性分別為88.4%、80.0%,提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平對(duì)肺結(jié)核具有較高的診斷價(jià)值。肺結(jié)核的活動(dòng)性,關(guān)系到患者的治療措施,及時(shí)診斷肺結(jié)核活動(dòng)性對(duì)肺結(jié)核患者治療至關(guān)重要[17]。本研究結(jié)果顯示,活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血miR-17-5p表達(dá)水平較非活動(dòng)性肺結(jié)核組顯著升高,提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平與肺結(jié)核患者活動(dòng)性密切相關(guān)。侯新月等[2]研究顯示,miR-24-3p區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者的敏感度、特異度分別為53.3%和100%。周冰等[5]研究表明,miR-144區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核患者與健康志愿者的敏感度、特異度分別為96.88%和96.77%。本研究使用外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核患者活動(dòng)性的敏感度、特異性分別為48.8%和90.9%,提示外周血miR-17-5p表達(dá)水平診斷肺結(jié)核患者活動(dòng)性的特異性較好,具有一定臨床參考價(jià)值。

    綜上所述,miR-17-5p在肺結(jié)核患者外周血中高表達(dá),在活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血中表達(dá)更高,其水平與炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯相關(guān),可用于輔助診斷肺結(jié)核及其活動(dòng)性。

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