過(guò)氧化物還原酶4蛋白對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

鄒小飛，梁秀茹，嚴(yán)正杰，崔毓桂，劉嘉茵，孟艷

顆粒細(xì)胞通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)、能量及物質(zhì)的交換，是卵巢中重要的細(xì)胞成分。顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的原因之一[1]，異常的卵泡閉鎖增加會(huì)影響卵巢功能。凋亡是受基因控制的主動(dòng)死亡過(guò)程，分為內(nèi)源性途徑（線粒體途徑）、外源性途徑（死亡受體途徑）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[2]。卵巢氧化微環(huán)境的建立和氧化還原穩(wěn)態(tài)的喪失是顆粒細(xì)胞凋亡的主要原因[3]。在病理狀態(tài)下活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平增加，抗氧化酶的表達(dá)及活性下降，導(dǎo)致ROS在顆粒細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步蓄積，進(jìn)而擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正常的氧化還原狀態(tài)，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)首先通過(guò)誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfold protein response，UPR）恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和過(guò)量的ROS以正反饋的方式相互作用并相互加強(qiáng)，最終ROS誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激決定細(xì)胞的狀態(tài)或命運(yùn)，如自噬、凋亡或衰老等[5]。過(guò)氧化物還原酶4（peroxiredoxin 4，Prdx4）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其有2個(gè)半胱氨酸殘基，通過(guò)清除過(guò)氧化氫（H2O2）抑制氧化應(yīng)激，與年齡相關(guān)性疾病（如癌癥、糖尿病和炎癥性疾病等）相關(guān)[6-8]。為深入探索Prdx4在顆粒細(xì)胞中的作用，本研究采用Prdx4小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)小鼠顆粒細(xì)胞Prdx4蛋白的表達(dá)，探討下調(diào)Prdx4表達(dá)水平對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒購(gòu)自南京源之信生物技術(shù)有限公司，蛋白裂解液及5×上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM/F12購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，蛋白酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，特超敏增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影液購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司，含細(xì)胞核熒光染料4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）的封片液購(gòu)自德國(guó)SBA公司，Prdx4單克隆抗體、B細(xì)胞淋巴瘤2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）單克隆抗體、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP） 單克隆抗體和轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）單克隆抗體和免疫球蛋白結(jié)合蛋白（binding immunoglobulin protein，BIP）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，ATF6單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，Bcl-2多克隆抗體和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase 3）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠均為SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠，購(gòu)于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)取8周齡小鼠，腹腔注射孕馬血清8 IU/只，36 h后頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取出卵巢，體式顯微鏡下用注射器針頭刺破卵泡，釋放出顆粒細(xì)胞，均勻接種入6孔板。另取部分顆粒細(xì)胞放置到有蓋玻片的培養(yǎng)皿，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人卵巢顆粒細(xì)胞（KGN）來(lái)自于生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.4 轉(zhuǎn)染siRNA待細(xì)胞融合率達(dá)到50%～60%，予siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以空白組作為對(duì)照，12 h后換液，24 h后提取細(xì)胞。部分細(xì)胞加入戊二醛固定后送南京醫(yī)科大學(xué)電鏡中心觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞經(jīng)蛋白裂解液裂解后取上清檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.5 免疫熒光將細(xì)胞爬片置于6孔板中，當(dāng)KGN細(xì)胞在爬片上融合率達(dá)70%～80%時(shí)，予4%多聚甲醛（paraformaldehyde solution，PFA）固定15 min，0.5%TritonX-100通透20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，山羊血清室溫下封閉30 min后孵育一抗Prdx4（1∶100）及PDI（1∶100）于4 ℃過(guò)夜。室溫孵育熒光標(biāo)記的二抗2 h，PBS清洗3次后DAPI室溫避光孵育1 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細(xì)胞至細(xì)胞漂?。s5 min），PBS反復(fù)清洗后，于4 ℃、2 000 r/min離心3 min，按照試劑盒說(shuō)明，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平收集2組處理后的細(xì)胞，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，取總蛋白樣品各40 μg進(jìn)行Western blotting。將在凝膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（250 mA，80 min），5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入Prdx4、BIP、ATF4、ATF6、CHOP、Bax、Bcl-2及cleaved caspase 3抗體于4 ℃過(guò)夜。次日用TBST洗膜3次后再加入抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫下孵育2 h。TBST洗膜3次后采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，用目的蛋白與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）及紐蛋白（Vinculin）條帶的灰度值之比表示檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上，采用GraphPad Prism7.04統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Prdx4在KGN細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位由于PDI特異性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，利用免疫熒光共定位，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光（Prdx4）與紅色熒光（PDI）位置重合，明確Prdx4主要定位于KGN細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。見(jiàn)圖1。

圖1 Prdx4 在KGN細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位（×600）

2.2 下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)后小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的改變Prdx4-siRNA處理組凋亡率較空白對(duì)照組增加[（23.900±4.431）%vs.（13.233±1.557）%，n=3，t=3.934，P=0.017]，見(jiàn)圖2A。Western blotting結(jié)果提示，Prdx4-siRNA處理組促凋亡因子Bax及cleaved caspase 3蛋白水平表達(dá)較空白對(duì)照組高（均P＜0.01），抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)水平較空白對(duì)照組下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖2B、表1。

表1 2組小鼠顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表1 2組小鼠顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別 n cleaved caspase 3 Bax Bcl-2空白對(duì)照組 3 0.590±0.081 0.866±0.027 1.025±0.051 Prdx4-siRNA處理組 3 1.282±0.154 1.204±0.049 0.787±0.110 t 6.909 10.450 3.409 P 0.002 0.001 0.027

圖2 小鼠顆粒細(xì)胞下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)后凋亡情況

2.3 下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)后小鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)改變通過(guò)透射電鏡對(duì)2組小鼠顆粒細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，Prdx4-siRNA處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴(kuò)張和增生。見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠顆粒細(xì)胞下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)的改變（×3 000）

2.4 下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)后小鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)情況采用Western blotting檢測(cè)2組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Prdx4-siRNA處理組Prdx4蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組下降（P＜0.01），BIP、ATF4和CHOP表達(dá)水平均較空白對(duì)照組升高（均P＜0.05），ATF6表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4、表2。

圖4 小鼠顆粒細(xì)胞下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 2組小鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 2組小鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別 n Prdx4 BIP ATF6 ATF4 CHOP空白對(duì)照組 3 1.057±0.126 0.563±0.169 0.943±0.106 0.373±0.139 0.567±0.145 Prdx4-siRNA處理組 3 0.469±0.080 0.967±0.162 0.671±0.486 0.959±0.149 1.013±0.162 t 6.859 2.982 0.948 4.975 3.549 P 0.002 0.041 0.397 0.008 0.024

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，在蛋白質(zhì)合成、加工修飾、氧化折疊、組裝和新生肽鏈的運(yùn)輸中起著重要作用[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原穩(wěn)態(tài)是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。一些生理和病理?xiàng)l件，包括氧化應(yīng)激、炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)喪失和病原體感染等都會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10]。在這種情況下，錯(cuò)誤折疊和未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，首先通過(guò)啟動(dòng)UPR增加蛋白質(zhì)氧化折疊能力并減少蛋白質(zhì)氧化折疊負(fù)荷來(lái)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。UPR是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的3個(gè)信號(hào)傳感器肌醇酶1α（inositol requiring enzyme 1α，IRE1α）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和ATF6的刺激下啟動(dòng)的。在生理?xiàng)l件下，這3個(gè)跨膜蛋白都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白BIP結(jié)合，處于非活性狀態(tài)[12]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，它們與BIP解離并被激活。細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)UPR抑制mRNA轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑（endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD）以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)平衡[13]。在慢性或過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能無(wú)法恢復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡[14]。

本研究通過(guò)免疫熒光共定位明確Prdx4定位于顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并論證了下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。據(jù)報(bào)道，Prdx4協(xié)同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1（endoplasmic reticulum oxidoreductin 1，ERO1）可促進(jìn)蛋白質(zhì)二硫鍵形成[15]。ERO1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的二硫鍵合成酶，在氧化折疊過(guò)程中產(chǎn)生H2O2。而Prdx4在介導(dǎo)二硫鍵形成的同時(shí)可消除ERO1產(chǎn)生的H2O2[16]，從而使蛋白質(zhì)氧化折疊更高效，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)Prdx4蛋白表達(dá)水平下調(diào)引起顆粒細(xì)胞凋亡水平增加，說(shuō)明Prdx4在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡中起著重要作用。

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，高度分泌的細(xì)胞如胰腺β細(xì)胞、漿細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴(kuò)張以代償大量的蛋白質(zhì)合成及運(yùn)輸。而在持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行性損傷，細(xì)胞功能不可逆地破壞，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究中透射電鏡顯示下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)的小鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴(kuò)張。隨后，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物BIP、UPR通路中的ATF6、UPR信號(hào)通路下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATF4以及CHOP的表達(dá)，結(jié)果表明下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)后的小鼠顆粒細(xì)胞BIP、ATF4和CHOP顯著升高。有研究表明，當(dāng)持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無(wú)法緩解時(shí)，PERK磷酸化真核翻譯啟動(dòng)因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α），從而抑制蛋白質(zhì)翻譯但促進(jìn)ATF4的翻譯[17]。ATF4可促進(jìn)凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP轉(zhuǎn)錄，CHOP通過(guò)線粒體依賴(lài)性途徑、死亡受體途徑及誘導(dǎo)ROS生成等其他方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著重要作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)CHOP表達(dá)可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[18]，而下調(diào)CHOP表達(dá)可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞凋亡[19]。CHOP通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白、上調(diào)促凋亡蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促凋亡蛋白又可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放并啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]，加速凋亡。本研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase 3表達(dá)水平升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了Prdx4表達(dá)下降引起持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡。

在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中經(jīng)歷著復(fù)雜的細(xì)胞、基因及遺傳變化，需要顆粒細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。這些細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成、折疊及成熟，并運(yùn)輸?shù)竭m當(dāng)位置。因而維持顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)對(duì)其分泌功能尤為重要。有研究表明，Prdx4缺乏導(dǎo)致B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化過(guò)程中錯(cuò)誤折疊的IgM蓄積[21]。Prdx4與胰島素原正確的氧化折疊有關(guān)[7]，并且Prdx4失活會(huì)加劇淀粉樣蛋白β寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[22]，進(jìn)一步明確了Prdx4在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的作用。同時(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在其他促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化折疊及抗氧化的基因，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶7/8（glutathione peroxidase 7/8，Gpx7/8）及維生素K環(huán)氧化物還原酶（vitamin K epoxide reductase，VKOR）等[23]。筆者推測(cè)Prdx4保護(hù)顆粒細(xì)胞的機(jī)制主要是通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞凋亡，且此作用無(wú)法通過(guò)顆粒細(xì)胞中的ERO1和其他抗氧化酶代償。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Prdx4蛋白表達(dá)可引起顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，表明Prdx4作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抗氧化劑，可通過(guò)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，從而抑制顆粒細(xì)胞凋亡。Prdx4維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。