高通量測(cè)序檢測(cè)流產(chǎn)組織染色體異常對(duì)治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的意義

何建萍 唐健 錢源,2 秦茂華 羅勝軍 呂夢(mèng)欣△

(1.昆明市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科，云南 昆明 650031；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032)

流產(chǎn)指胚胎或胎兒在著床后20周內(nèi)自發(fā)丟失，據(jù)報(bào)道顯示10%～15%的妊娠會(huì)發(fā)生流產(chǎn)[1]。其中大多數(shù)流產(chǎn)發(fā)生在妊娠的前三個(gè)月(未滿13周)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)被定義為兩次或兩次以上的妊娠丟失，3%～5%的妊娠夫婦會(huì)發(fā)生[2]。 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)由很多因素造成的，有些來(lái)源于母體原因，例如TORCH感染，甲狀腺功能減退，子宮異常等；有些因素是胎兒和母親之間免疫反應(yīng)的結(jié)果[3]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)最常見(jiàn)的胎兒原因是染色體異常，在第一胎的比例占到50%[4]。傳統(tǒng)的染色體分析方法是進(jìn)行外周血染色體核型分析，其主要限制因素包括對(duì)活體組織的需求、培養(yǎng)不合格(約10%～40%)、母細(xì)胞污染以及分辨率有限(通常低于5～10 Mb)等[5]。高通量測(cè)序技術(shù)分析用于檢測(cè)整個(gè)基因組中的拷貝數(shù)變異(CNV)，分辨率低至10kb。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)羊水標(biāo)本的染色體非整倍體和基因拷貝數(shù)的靈敏度和特異性均為100%[6]。本文通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織進(jìn)行檢測(cè)，分析染色體異常對(duì)胎兒復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響，對(duì)夫婦再次妊娠進(jìn)行指導(dǎo)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年5月至2019年5月在昆明市婦幼保健院及協(xié)作醫(yī)院產(chǎn)科門診的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛組織(流產(chǎn)次數(shù)≥2次)，共207例，患者年齡介于20～44歲，平均31歲，胚胎停育孕周介于6～9周，召回69對(duì)夫婦進(jìn)行常規(guī)外周血染色體核型分析，均詢問(wèn)接觸史、孕產(chǎn)史和家族史。所有患者均充分知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法 (1)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè):自2017年5月至2019年5月共對(duì)207例流產(chǎn)組織進(jìn)行高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)。將胎兒絨毛組織用生理鹽水清洗3～5次，通過(guò)DNA提取試劑盒(QIAamp 試劑盒，51306)提取DNA后構(gòu)建文庫(kù)，質(zhì)檢合格后上機(jī)測(cè)序(Life Tech，DA8600)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和解讀。(2)夫婦染色體外周血染色體核型分析:經(jīng)知情同意對(duì)召回的69對(duì)夫婦進(jìn)行常規(guī)外周血染色體G顯帶核型分析，將外周血接種于細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥)，培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞收獲，離心3000轉(zhuǎn)5 min，經(jīng)低滲、固定、滴片、烤片、顯色、染色、分帶后使用全自動(dòng)核型分析系統(tǒng)(美國(guó)萊卡，GSL-120)掃描分析20個(gè)圖像。

2 結(jié) 果

2.1高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)果 在檢測(cè)的207例流產(chǎn)組織中，檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)異常為93例，占44.9%；片段缺失或重復(fù)為23例，占11.1%；X單體和16三體均為18例，均占總體的8.7%；22三體為12例，所占比例為5.8%。另外三倍體和XY/XX嵌合分別為8和7例。見(jiàn)表1。

表1 流產(chǎn)組織高通量測(cè)序檢測(cè)結(jié)果[n，207例]

2.2高通量測(cè)序檢測(cè)陽(yáng)性比 207例流產(chǎn)組織中檢出染色體異常例數(shù)為114例，所占比例55.1%，包括58例染色體三體，約占異常類型結(jié)果的50.9%；18例X染色體單體，約占異常結(jié)果的15.8%；23例片段缺失或重復(fù)的染色體，約占異常結(jié)果的20.2%；8例三倍體，約占異常結(jié)果的7.0%；7例XX/XY嵌合體，約占異常結(jié)果的6.1%(見(jiàn)圖1A)。圖1B示為一例13q11-q34存在約95.76M片段重復(fù)和19p12存在約0.32M片段重復(fù)的患者高通量檢測(cè)結(jié)果。13號(hào)染色體三體，也稱為Patau綜合征，絕大多數(shù)會(huì)發(fā)生自然流產(chǎn)。

2.3親本染色體核型結(jié)果分析 共召回69對(duì)夫婦進(jìn)行外周血染色體核型檢測(cè)。69例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織高通量測(cè)序結(jié)果中49例未見(jiàn)異常，親本核型檢測(cè)結(jié)果均為未見(jiàn)異常，但其中其中不明家族史1例，少精癥3例，子宮發(fā)育異常1例；高通量結(jié)果為片段缺失/重復(fù)者共8例，對(duì)應(yīng)親本檢測(cè)結(jié)果3對(duì)為未見(jiàn)異常，6對(duì)夫婦中均有一方為平衡易位，其中1例精子活力弱；高通量測(cè)序結(jié)果為三體者有9例，親本檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)異常7例，1例平衡易位，1例小Y；通量結(jié)果為X單體者2例，親本檢測(cè)結(jié)果均未見(jiàn)異常；高通量結(jié)果為三倍體1例，夫妻雙方檢測(cè)結(jié)果均為9號(hào)臂間倒位。

注：A.207例流產(chǎn)組織中染色體異常檢出情況；B.高通量測(cè)序技術(shù)檢出染色體微重復(fù)及重復(fù)所在具體區(qū)域。圖1 流產(chǎn)組織高通量測(cè)序檢測(cè)異常結(jié)果

2.4年齡與高通量測(cè)序結(jié)果的相關(guān)性分析 在207例受檢者中，年齡大于35歲組胎兒染色體異常陽(yáng)性率為65.52%(38/58)，低于35歲組胎兒染色體異常陽(yáng)性率為50.34%(75/149)，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)不同年齡組胎兒染色體異常陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 年齡與高通量結(jié)果的相關(guān)性分析[n(%)]

3 討 論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能源于多種因素，如遺傳因素或母體結(jié)構(gòu)異常因素、感染因素、免疫因素，以及其他未知因素[7]。本研究對(duì)207例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織進(jìn)行檢測(cè)并分析，其中染色體異常類型共檢出114例，包括58例染色體三體，18例X染色體單體，8例三倍體，7例46,XX/46,XY嵌合體，23例片段缺失或重復(fù)的染色體；染色體異常檢出率為55.1%，染色體異常率與相關(guān)報(bào)道一致[8-9]。上述結(jié)果提示染色體異常是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要原因。

胎兒染色體非整倍體(胎兒染色體三體或單體或胎兒常染色體異常)是遺傳因素中導(dǎo)致早期反復(fù)妊娠丟失的最常見(jiàn)原因，這些異常在所有人類生育的常見(jiàn)問(wèn)題至少占5%[10]。三體多為偶發(fā)性，非遺傳性，可能為減數(shù)分裂I期染色體的異常配對(duì)和分配將形成非整倍體的配子，這種類型通常在妊娠8周之前終止[11]。本次研究顯示染色體三體共檢出58例，約占異常結(jié)果50.9%，其中16三體所占比例最高，其次是22三體。X單體是人類唯一能生存的單體綜合征，患者第二性征發(fā)育不全且伴有原發(fā)性閉經(jīng)[12]。45，X0是最多見(jiàn)的一型且具有較為典型的臨床表現(xiàn)。本此研究檢出18例X染色體單體，約占15.8%。此類異常發(fā)生主要為偶發(fā)性、非遺傳性，此類檢出者再次妊娠時(shí)應(yīng)建議孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

本研究檢出三倍體8例，陽(yáng)性率為3.9%。據(jù)報(bào)道三倍體大約發(fā)生于2%的妊娠，是早孕期自然流產(chǎn)中常見(jiàn)的染色體畸變，其形成原因?yàn)殡p精受精或雙雌受精[13]。檢出46,XX/46,XY嵌合體7例，約占異常結(jié)果6.1%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)生人類異源嵌合體大致有三種機(jī)制：第一種是2個(gè)胚胎融合；第二種機(jī)制是卵子和第二極體雙受精；第三種機(jī)制是單個(gè)卵子經(jīng)孤雌分裂產(chǎn)生2個(gè)DNA相同的單倍體的配子雙受精，融合發(fā)育成的個(gè)體[14]。對(duì)此異常發(fā)生者進(jìn)行充分遺傳咨詢，告知夫妻備孕時(shí)應(yīng)避免接觸可能導(dǎo)致染色體畸變的因素。

傳統(tǒng)染色體異常的分子檢測(cè)方法主要針對(duì)特定染色體序列或片段，由最初檢測(cè)大突變到后續(xù)檢測(cè)小突變，如FISH、QF-PCR等檢測(cè)技術(shù)。隨著下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)的發(fā)展，所有患者或攜帶者的變異類型的綜合突變篩選都可以在一個(gè)平臺(tái)上進(jìn)行。與常規(guī)染色體核型分析相比，高通量測(cè)序技術(shù)可以直接從胎兒細(xì)胞中純化的DNA進(jìn)行，無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，因此可以更快地獲得結(jié)果而且可以減少細(xì)胞培養(yǎng)失敗的風(fēng)險(xiǎn)[15]。此外，高通量測(cè)序技術(shù)可以檢出常規(guī)染色體核型分析無(wú)法識(shí)別的微缺失微重復(fù)，并可以對(duì)重復(fù)區(qū)域的片段給出準(zhǔn)確的信息，協(xié)助臨床進(jìn)行診斷、咨詢。本文中檢出片段缺失或重復(fù)的染色體23例，約占異常結(jié)果20.2%；推測(cè)親本存在染色體異常可能(如染色體平衡易位)，建議對(duì)夫婦雙方進(jìn)行外周血染色體檢測(cè)或高通量測(cè)序。對(duì)親本存在染色體異常的夫婦進(jìn)行充分的遺傳咨詢，對(duì)有相關(guān)指征者可建議夫婦行試管嬰兒技術(shù)。

本文研究結(jié)果顯示孕婦不同年齡段復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織中染色體異常檢出存在一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如表2所示，結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。本文檢測(cè)69對(duì)親本外周血檢測(cè)染色體異常共計(jì)9對(duì)，染色體異常攜帶率約占13%，本結(jié)果提示遺傳因素導(dǎo)致胎兒染色體異常是發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要原因，但本文親本染色體異常攜帶率高于文獻(xiàn)報(bào)道[17]，推測(cè)樣本量大小對(duì)結(jié)果存在一定影響。

總言之，染色體異常仍然是流產(chǎn)的主要原因。通過(guò)使用高通量測(cè)序技術(shù)可以更快速，準(zhǔn)確、全面地檢出復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組織染色體異常情況，為臨床遺傳咨詢提供有力支持，為夫婦繼續(xù)妊娠提供有效指導(dǎo)。