類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎間質(zhì)性肺疾病動(dòng)物模型概述

敖琴 李龍△ 劉俊 李俊媛 李培霆

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，貴州 貴陽 550004；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院感染科，湖北 武漢 430022)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種病因不明的慢性自身免疫性疾病，病變主要位于四肢小關(guān)節(jié)，隨著疾病發(fā)展，可累及全身各個(gè)系統(tǒng)，其中ILD是最常見的關(guān)節(jié)外改變。RA患者中有2%～10%可發(fā)展為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎間質(zhì)性肺疾病(rheumatoid arthritis- interstitial lung disease ,RA-ILD)[1]；近年來RA的總體死亡率有所下降，但I(xiàn)LD卻成為RA患者主要死亡原因之一，并呈逐年上升趨勢(shì)，占所有RA相關(guān)死亡的7-13%[2]。RA-ILD表現(xiàn)為肺部不同程度的炎癥和纖維化活動(dòng)，該過程被認(rèn)為是漸進(jìn)的，并在很大程度上不可逆轉(zhuǎn)，其中常見的病理類型為普通間質(zhì)性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)和非特異間質(zhì)性肺炎(non-specific interstitial pneumonia,NSIP)，而UIP在RA-ILD中最常見，表現(xiàn)為明顯的致密纖維化和肺結(jié)構(gòu)重塑[3]。目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，ILD是由遺傳和環(huán)境因素共同造成，但具體病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚；臨床上大多數(shù)患者在肺部出現(xiàn)明顯癥狀、肺功能顯著受損后才被明確診斷，這對(duì)于RA-ILD的早期識(shí)別及延緩疾病進(jìn)展是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)[4]。要想進(jìn)一步深入研究，選擇合適的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)進(jìn)展的關(guān)鍵步驟。而UIP作為RA-ILD中最常見的病理類型，所以在造模過程中，通常參考UIP動(dòng)物模型的造模方法。報(bào)告如下。

1 博來霉素誘導(dǎo)

博來霉素(bleomycin,BLM)為鏈霉菌中提取出來的一種細(xì)胞毒性藥物，在臨床上被作為抗腫瘤藥物使用，因其副作用可導(dǎo)致肺纖維化，所以在研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾病發(fā)病機(jī)制方面，常采用BLM誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型[5]。BLM的給藥方式包括氣管內(nèi)給藥、霧化、尾靜脈注射、腹腔注射等，目前常用的方法為氣管內(nèi)給藥[6-7]。有研究比較了氣管內(nèi)灌注和Penncentur動(dòng)物霧化器氣管內(nèi)霧化兩種方法結(jié)果顯示，Penncentur霧化器氣管內(nèi)霧化造成的小鼠肺纖維化病灶分布更均勻，而且可降低繼發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)，但與傳統(tǒng)口鼻暴露霧化吸入相比，Penncentur氣管內(nèi)霧化操作復(fù)雜，費(fèi)用較高[8]。而對(duì)于BLM的使用劑量，根據(jù)所選動(dòng)物類型、藥物使用方式的不同，在劑量上的運(yùn)用也存在著顯著差異，目前國(guó)內(nèi)尚無確切的標(biāo)準(zhǔn)。BLM誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型早期表現(xiàn)為間質(zhì)性炎癥和血管損傷，晚期以肺間質(zhì)纖維化形成為特點(diǎn)[9]。王鶴、Mahmutovic Persson等[10-11]均使用SD大鼠作為模型，通過連續(xù)氣管內(nèi)灌注BLM的第3天，支氣管肺泡灌洗液的總蛋白量、炎性細(xì)胞以及血漿滲出量開始增加，肺組織Masson染色顯示肺間質(zhì)開始出現(xiàn)紅細(xì)胞和部分炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，磁共振檢查肺部也出現(xiàn)了肺總體積增加；而在之后的第7、21、28天炎癥有所緩解，小鼠肺間隔呈中、重度增厚，肺泡結(jié)構(gòu)消失，成纖維細(xì)胞及膠原基質(zhì)的沉積顯著。 周平[12]也采用SD大鼠器官灌注BLM，在連續(xù)給藥的第7天小鼠肺組織HE染色后表現(xiàn)為急性炎癥損害病灶，第14天后炎癥有所緩解，但出現(xiàn)成纖維細(xì)胞的增生、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，第28天肺泡破壞嚴(yán)重，肺泡間隔大量膠原和纖維蛋白沉積。以上BLM誘導(dǎo)的病變主要集中在肺組織，其他器官暫未出現(xiàn)損傷表現(xiàn)。通過BLM誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺疾病，技術(shù)成熟，造模周期短，形成的間質(zhì)性肺部疾病相對(duì)穩(wěn)定；然而與RA-ILD的不可逆性、緩慢進(jìn)展性以及形成背景的特點(diǎn)相比，該方法雖具有強(qiáng)大的可重復(fù)性和通用性，但其本身仍不能確切的復(fù)制出RA-ILD，在還原其病理變化上仍有所不足[13]。

2 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)是目前最常用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型誘導(dǎo)方法，在很大程度上能復(fù)制出RA的病理狀態(tài)，且造模成功率較高，但在疾病模型的誘導(dǎo)中，關(guān)節(jié)外的病變研究相對(duì)較少，以常見的肺間質(zhì)疾病為例，只有少部分研究描述了在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的前提下，可發(fā)生肺部炎癥的變化。高波、Y.Terasaki[14-15]在利用CIA造模過程中，選擇恢復(fù)期小鼠提取肺組織染色發(fā)現(xiàn)肺部外周血存在大量正球形、著色較深的外周血淋巴細(xì)胞以及大量紅細(xì)胞，同時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，肺間隔增厚，毛細(xì)血管出現(xiàn)擴(kuò)張，且TNFα、IL-6、IL-β的表達(dá)均明顯上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。E.Schurgers等[16]利用γ干擾素受體敲除小鼠在CIA的誘導(dǎo)下，于免疫后的第21天小鼠肺表面發(fā)現(xiàn)有巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞組成白色半透明斑塊，并且在血管周圍和細(xì)支氣管周圍出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，肺間質(zhì)也含有類似于風(fēng)濕結(jié)節(jié)的肉芽組織樣結(jié)構(gòu)浸潤(rùn)。之后Tomomi Sato[17]發(fā)現(xiàn)在首次免疫后的第7天，CIA小鼠胸膜下區(qū)開始出現(xiàn)炎性細(xì)胞的聚集，抗CCP抗體也在血清中被檢測(cè)到；免疫后第49天肺HE染色發(fā)現(xiàn)肺周圍，尤其胸膜下區(qū)域，炎癥細(xì)胞呈片狀間質(zhì)浸潤(rùn)，其中以M2表型的CD11b巨噬細(xì)胞增多為主，該表性的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)纖維化的發(fā)生；此外還有IgG和補(bǔ)體C3沉積、抗瓜氨酸纖維蛋白抗體(ACPAs)產(chǎn)生，但之后該肺部表現(xiàn)逐漸減弱，免疫后第105天和161天額外免疫也未出現(xiàn)膠原沉積，也未顯示明顯的纖維化跡象，第182天肺組織的炎性改變及膠原沉積不再被觀察到。通過CIA誘導(dǎo)的RA-ILD模型，雖然目前有關(guān)研究較少，但根據(jù)CIA小鼠肺部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)部位、補(bǔ)體和ACPAs滴度增高等表現(xiàn)來看，這種模型與人類RA-ILD明顯相似。只是目前認(rèn)為CIA所導(dǎo)致的小鼠肺改變是可逆的，沒有進(jìn)一步纖維化的跡象[18]。因此CIA模型造成肺部炎癥變化或許可作為RA-ILD早期發(fā)病機(jī)制研究模型建立基礎(chǔ)。

3 腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)模型

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是RA和肺疾病持續(xù)進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子[19]。Cazlaris H等[20]曾在以C57BL/6CBA為背景下，獲得了腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)基因(tumor necrosis factor transgenic,TNF-TG)小鼠，該過程為通過一個(gè)包含編碼整個(gè)人類TNF-α基因片段的靶向載體，其中含有ARE的3‘UTR被來自β-珠蛋白基因的3’UTR取代，植入這種靶向載體后，可增加TNF-α基因的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而通過全身過表達(dá)TNG-α，導(dǎo)致炎性侵襲性關(guān)節(jié)炎。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在TNF-TG小鼠模型中，除有典型的關(guān)節(jié)炎病變外，還存在著ILD，并且表現(xiàn)為慢性、漸進(jìn)性改變，與人RA-ILD更為相似[21-22]。Richard D.Bell等[23]曾利用TNF-TG小鼠誘導(dǎo)出ILD，并采用肺微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(MCT)小鼠肺組織，結(jié)果顯示TNF-TG小鼠在所有時(shí)間點(diǎn)的組織體積、總肺體積和平均強(qiáng)度都顯著增高。此外Emily K.Wu等[24]同樣曾利用TNF-TG小鼠誘導(dǎo)ILD，與正常對(duì)照組比較后提示TNG-TG小鼠的氣體交換能力受損，呼吸阻力增加，吸氣量顯著降低，肺順應(yīng)性、彈性也均降低。然而該實(shí)驗(yàn)沒在病變肺組織發(fā)現(xiàn)膠原沉積的改變，但在肺間質(zhì)組織中存在明顯的炎性細(xì)胞聚集。與人RA-ILD的肺纖維化改變相比，TNF-TG模型雖不能完全描述臨床疾病的所有方面，但可用來闡釋TNF驅(qū)動(dòng)的炎癥和間質(zhì)性肺疾病間的關(guān)系。

4 其 他

除上述方法外，F(xiàn)U Yalu等[25]在CIA模型全身免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上聯(lián)合BLM誘導(dǎo)小鼠間質(zhì)性肺疾病，該模型呈現(xiàn)出全身慢性炎癥反應(yīng)進(jìn)行性肺纖維化持續(xù)加重的病理，與RA-ILD的臨床表現(xiàn)更為接近。而SKG小鼠，因編碼ZAP-70 SH2結(jié)構(gòu)域的基因突變，可自發(fā)發(fā)生T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性自身免疫性關(guān)節(jié)炎，通過腹腔注射酵母多糖的SKG小鼠可因自我耐受的破壞引起關(guān)節(jié)癥狀和ILD，因此亦可通過上述方法在該類型小鼠中研究自身免疫性關(guān)節(jié)炎背景下引起的ILD[26]。此外，也有利用基因工程手段來建立肺纖維化模型的研究，L.William E等[27]利用表面活性蛋白C(SFTPC)、表面活性蛋白-A2 (SFTPA2)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和端粒酶RNA(TERC)這四個(gè)基因來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，再運(yùn)用四環(huán)素誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)或關(guān)閉，從而構(gòu)建肺纖維化小鼠動(dòng)物模型。

5 展 望

目前國(guó)內(nèi)無論在研究RA-ILD還是其他原因所導(dǎo)致的肺間質(zhì)纖維化，通常為單獨(dú)復(fù)制肺部病變的模型，如BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型仍然是最常用且相對(duì)成熟的方法，但值得注意的是與人RA-ILD相比，該病變只局限在肺組織，并未引起關(guān)節(jié)受損。CIA和TNF-TG小鼠誘導(dǎo)的模型可兼并關(guān)節(jié)炎和間質(zhì)性肺疾病兩種疾病狀態(tài)，這更加接近人RA-ILD的病理改變，而且更符合RA-ILD早期發(fā)病是在炎性自身免疫條件下發(fā)生的機(jī)制特點(diǎn)。但不足之處在于上述模型的肺部病變程度普遍較輕，且通常為可逆性改變。因此，要想獲得構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)易且經(jīng)濟(jì)、全面反映人RA-ILD特征的動(dòng)物模型，仍是亟需不斷深入研究的內(nèi)容之一。