攀枝花黑松露多糖的抗氧化和降血糖活性

魏鑫悅，陳克保，關(guān)統(tǒng)偉

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610039）

氧化是生物產(chǎn)生能量的重要過(guò)程，然而，人體在代謝過(guò)程中會(huì)不可避免地產(chǎn)生自由基，自由基容易誘發(fā)各種病理效應(yīng)，如動(dòng)脈粥樣硬化和衰老[1]。只有體內(nèi)的自由基處于一定的動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，才能維持機(jī)體運(yùn)行，因此有必要開(kāi)發(fā)和利用有效的抗氧化劑來(lái)消除人體內(nèi)的自由基[2]。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，可以通過(guò)胰島素和口服雙胍類、磺脲類等降糖藥物進(jìn)行治療[3]。然而，這些治療方式會(huì)引起腸道紊亂、低血糖等副作用[4]。因此，尋找副作用更少的有效替代品迫在眉睫。

多糖是生物活性大分子，同時(shí)也是松露的重要成分之一，對(duì)生物細(xì)胞無(wú)毒副作用，具有多種生物活性，如抗氧化活性[5]、降血糖活性[6]、抗炎活性[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、降血脂[9]等。有研究證實(shí)松露多糖的抗氧化能力取決于多糖的分子量、硫酸酯化含量、分支度和糖苷鍵類型[10,11]，其降血糖活性則與多糖的分子量、糖苷鍵、高級(jí)結(jié)構(gòu)、基團(tuán)、硫酸酯化、羧甲基化以及乙酰化密切相關(guān)[12]。黑松露也稱“黑鉆石”，是一種藥食兩用的野生型真菌，具有濃烈而獨(dú)特的香味，常作為食品和香料的原料[13]。成熟的黑松露具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含氨基酸、維生素、甾醇和微量元素等，也可以通過(guò)增強(qiáng)免疫力、益胃、抑制腫瘤等多種途徑促進(jìn)人體健康[14,15]。然而不同品種和不同地理環(huán)境的松露，其多糖成分在結(jié)構(gòu)和生物活性方面存在一定程度的差異，從而影響其營(yíng)養(yǎng)和生物活性。本論文以攀枝花黑松露多糖為研究對(duì)象，探索其結(jié)構(gòu)及其抗氧化、降血糖活性，為攀枝花黑松露及其多糖的深度開(kāi)發(fā)提供理論及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

本研究中黑松露采自四川省攀枝花市鹽邊縣新九鄉(xiāng)山區(qū)，40 ℃烘干處理，粉碎后過(guò)80目篩，得到黑松露粉。

實(shí)驗(yàn)中所用主要試劑有：無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、D-葡萄糖醛酸、α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、α-淀粉酶、維生素C、TPTZ、阿卡波糖等，均為常規(guī)國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)于成都迪維樂(lè)普科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀-示差檢測(cè)器，Waters；TSK-GEL G4000PWXL凝膠色譜柱，TOSOH；COXEM EM30Plus掃描電鏡，韓國(guó)庫(kù)塞姆公司；I3X多功能酶標(biāo)儀，美谷（上海）分子儀器有限公司；Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛公司；其余均為通用設(shè)備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑松露粗多糖的提取

取20 g研磨后的松露粉末，加20倍水混勻，80 ℃熱水浴提取2 h后用布氏漏斗抽濾，收集濾液；60 ℃下進(jìn)行減壓濃縮后加入4倍體積的95%乙醇于4 ℃沉淀中過(guò)夜，在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集沉淀，得到粗多糖。

1.3.2 粗多糖的純化

將粗多糖溶解后，按體積比5:1的比例加入Sevage試劑，充分搖勻后在4000 r/min下離心5 min，收集位于上層的糖液，去除蛋白。將多糖凍干后配制成濃度為10 mg/mL的溶液，用葡聚糖凝膠Sephadex G-200層析柱純化，每次的上樣體積為1 mL，用蒸餾水洗脫，流速6 s/滴，1 min/管。將收集的各管糖液按苯酚硫酸法測(cè)OD490，根據(jù)試管標(biāo)號(hào)和OD490繪制洗脫曲線，并且得到凍干粉，備用。

1.3.3 多糖純度鑒定

參考于曉鳳[16]的方法對(duì)多糖樣品進(jìn)行純度鑒定。取3.0 mL濃度為1 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水作空白對(duì)照，在190～400 nm波長(zhǎng)下對(duì)攀枝花黑松露純多糖進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。觀察260 nm和280 nm兩處是否存在特征吸收峰，從而判斷純化后的多糖是否含有蛋白質(zhì)和核酸。

1.3.4 黑松露多糖的結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 分子量測(cè)定

分子量測(cè)定參照王海燕等[7]的研究，用凝膠色譜對(duì)黑松露的分子量分布進(jìn)行測(cè)定。將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000用KH2PO4配成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，同時(shí)上樣量為20 μL，測(cè)定出峰時(shí)間。以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對(duì)數(shù)值logMW為橫坐標(biāo)，以分子量的微分分布dwt/d(logM)為縱坐標(biāo)，繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 傅立葉紅外光譜分析

精確稱取1 mg多糖樣品，加適量的干燥KBr粉末，混合研磨均勻后，在壓片機(jī)上進(jìn)行壓片，制成透明薄片。將制好的壓片利用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描范圍為400～4000 cm-1，采集樣品的紅外吸收光譜。

1.3.4.3 單糖組成分析

參考向瑩等[17]的方法，并做適當(dāng)處理：在試管中加入400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液或多糖水解液、400 μL PMP甲醇溶液，使用渦旋混合器混合均勻；放入70 ℃的水浴中反應(yīng)2 h后取出并冷卻至室溫，加400 μL 0.3 mol/L的HCl中和（pH 6～7），再加水1200 μL和等體積的氯仿，使用渦旋混合器混合均勻；放置一段時(shí)間，棄掉氯仿相，重復(fù)萃取幾次。將水相用微孔膜（0.45 μm）進(jìn)行過(guò)濾，打入高效液相色譜進(jìn)行分析。

1.3.4.4 掃描電子顯微鏡分析

參考 Fan等[18]的方法對(duì)攀枝花黑松露多糖進(jìn)行掃描電鏡分析。將充分干燥的多糖樣品固定在樣品臺(tái)上，在濺射一層金后，對(duì)樣品進(jìn)行檢查并放入掃描電鏡內(nèi)觀察樣品形態(tài)和結(jié)構(gòu)（放大倍數(shù)為1000倍、4300倍）。

1.3.5 黑松露多糖的抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

分別取不同濃度的樣品100 μL置于96孔板中，再分別加入15 μL的0.4 mmol/L DPPH，混勻，避光放置30 min，使其充分反應(yīng)，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度A1；用乙醇代替DPPH重復(fù)上述操作，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度A2，用水做空白對(duì)照得吸光度A0，并以維生素C做陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。DPPH自由基清除能力計(jì)算公式為：

1.3.5.2 羥自由基清除率

將多糖樣品配置成不同濃度（0.01～0.30 mg/mL）的樣品溶液，依次加入2.5 mL亞硫酸鐵（9 mmol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L）、1 mL過(guò)氧化氫（9 mmol/L），在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，4000×g離心10 min，于520 nm處測(cè)吸光度值B。用乙醇代替水楊酸-乙醇溶液得吸光度值B0，用水做空白對(duì)照得吸光度值A(chǔ)，并以維生素C做陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。羥自由基的清除能力計(jì)算公式為：

1.3.5.3 鐵還原抗氧化能力測(cè)定

取不同濃度的樣品（0.1～1.2 mg/mL）100 μL，依次加入400 μL濃度為0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH=3.6）、40 μL濃度為10 mmol/L的TPTZ溶液、40 μL濃度為20 mmol/L的三氯化鐵溶液，混合均勻，37 ℃水浴10 min，于590 nm處測(cè)定吸光度值。以不同濃度的七水合硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)上述操作，同時(shí)以七水合硫酸亞鐵濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.6126x+0.4934（R2=0.9966），計(jì)算樣品抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)，并以維生素C做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 黑松露多糖的降血糖活性

黑松露多糖的降血糖活性實(shí)驗(yàn)參照等Lv等[19]的研究，并做適當(dāng)修改。

α-淀粉酶抑制活性測(cè)定：將多糖樣品配置成不同濃度（0.5～3.0 mg/mL）的樣品溶液；用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液配制0.6 mg/mL的α-淀粉酶溶液和2.0 mg/mL的淀粉溶液。取 100 μL 樣品溶液加入100 μLα-淀粉酶溶液和淀粉溶液，于37 ℃培養(yǎng)20 min后加入500 μL DNS沸水浴5 min，在535 nm處測(cè)得吸光度A1。用磷酸緩沖液代替待測(cè)溶液，測(cè)得吸光度A2；以蒸餾水和磷酸鹽緩沖液分別取代待測(cè)液和α-淀粉酶溶液，測(cè)的吸光度為A0、A3。實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3組重復(fù)，α-淀粉酶抑制能力的公式為：

α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定：配制不同濃度的（0.5～3.0 mg/mL）的樣品溶液；用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）配制0.01 mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液；配制2.5 mmol/L的pNPG溶液、0.1 mol/L的碳酸鈉溶液。取100 μL樣品溶液加入等體積的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴15 min，加100 μL的pNPG溶液，37 ℃水浴10 min，最后加入5 mL碳酸鈉溶液使其停止反應(yīng)，于410 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)1。用蒸餾水做空白對(duì)照得吸光度值A(chǔ)0；用磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液，得到吸光度值B，同時(shí)以阿卡波糖做陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)，α-葡萄糖苷酶抑制能力的公式為：

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，Origin 2018軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26軟件計(jì)算抗氧化活性和降血糖活性的半抑制濃度（IC50值）。方差分析采用Dunnett檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的提取與純化

本試驗(yàn)表明攀枝花黑松露粗多糖得率為4.52%，這比較于張存艷等[20]采用干燥方式測(cè)多糖的得率（7.56%）有所降低，這可能是由于地理位置、干燥方法以及提取方法的差異導(dǎo)致。將所得粗多糖經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-200層析柱純化，繪制洗脫曲線（圖1），收集主要出峰的43～45管糖液，濃縮、干燥后得到純化的黑松露多糖。

2.2 多糖純度鑒定結(jié)果

由紫外吸收掃描圖（圖2）可知，該多糖在260 nm與280 nm處無(wú)吸收峰，說(shuō)明純化后的多糖不含蛋白與核酸，該多糖純化徹底。

2.3 分子量

凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，簡(jiǎn)稱 GPC）是根據(jù)相對(duì)分子量的大小將聚合物中不同的分子進(jìn)行分離，分子量越小保留時(shí)間就越長(zhǎng)，具有方便易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可用于多糖分子量的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的攀枝花黑松露的數(shù)均分子量Mn為1.29×104u，該分子量的多糖還未有報(bào)道。

2.4 傅立葉紅外分析

傅立葉紅外變換光譜圖是分子中基團(tuán)振動(dòng)能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的。根據(jù)攀枝花黑松露多糖的紅外光譜圖（圖4）可知：該多糖在3404.81 cm-1處有吸收峰，是由O-H伸縮振動(dòng)所引起[21]；在2927.41 cm-1處的吸收峰，說(shuō)明有C-H存在[22]；在1641.63 cm-1的吸收峰，可能是由于C=O的不對(duì)稱伸縮而引起的振動(dòng)所導(dǎo)致；在1419.83 cm-1處的吸收峰，這是由于 C-H 變角振動(dòng)引起[23]；1200～1000 cm-1的吸收峰可能是吡喃環(huán)伸縮振動(dòng)所引起的，同時(shí)也是多糖的典型吸收區(qū)域[24]。此外，該多糖的紅外掃描結(jié)果在578.51 cm-1處還有吸收峰，表明該黑松露多糖中糖苷鍵為α-型，且在糖醛酸對(duì)應(yīng)的1740 cm-1沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明該黑松露多糖不含糖醛酸，即為中性糖[25]。

2.5 單糖組成

黑松露多糖經(jīng)過(guò)水解以后，采用衍生法對(duì)多糖進(jìn)行衍生化，黑松露多糖帶上共軛基團(tuán)后在紫外區(qū)有吸收峰，然后使用高效液相色譜分析[26]。攀枝花黑松露主要是由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖組成，這四種單糖的摩爾比為 2.89:1.81:0.34:0.50，其中甘露糖含量最大，其次是葡萄糖。有研究表明，多糖的單糖組成會(huì)影響其高級(jí)結(jié)構(gòu)，大部分具有降血糖功能的多糖都含有葡萄糖、半乳糖[15]。

2.6 掃描電子顯微鏡分析

該多糖組分的表面形態(tài)如圖6所示。在放大1000倍電鏡下（圖 5a）觀察到該多糖呈塊狀堆積結(jié)構(gòu)，放大4300倍（圖5b）呈瘤狀突起形態(tài)。

2.7 黑松露多糖的抗氧化活性

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基，其有機(jī)溶液呈紫色，溶液的變色程度與其接受的電子數(shù)量（自由基清除活性）成定量關(guān)系，因而可以用于評(píng)價(jià)抗氧化活性[27]。通過(guò)圖7a可知，黑松露多糖具有清除DPPH自由基和羥自由基的能力，但清除作用低于對(duì)照維生素C。在一定的濃度范圍內(nèi)，清除自由基的能力隨著多糖溶液濃度的增大而增大，并且這一趨勢(shì)與維生素C相同。在濃度為3 mg/mL時(shí)，該多糖對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率是最大的，分別為64.29%和52.42%。

FRAP是一種基于氧化還原反應(yīng)的比色法。在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ被抗氧化劑還原成Fe2+-TPTZ，溶液變成深藍(lán)色，并且在593 nm處有強(qiáng)吸收。由圖7b可知該多糖的鐵還原能力與濃度有依賴關(guān)系，在一定范圍內(nèi)隨著多糖濃度的增大鐵還原能力也會(huì)隨之增強(qiáng)。

多糖的抗氧化活性與它的化學(xué)結(jié)構(gòu)有著密切聯(lián)系。例如，Liu等[28]從松露中提取出TP1、STP1和STP2三個(gè)組分中主要的單糖都是葡萄糖，這些組分都具有較強(qiáng)的抗氧化性能。本研究測(cè)定了攀枝花黑松露的單糖組成，發(fā)現(xiàn)其也主要由葡萄糖組成，也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性，這與上述研究一致。

通過(guò)計(jì)算，得到該多糖清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.02 mg/mL、1.82 mg/mL，Vc清除 DPPH自由基和羥自由基的 IC50值分別為 0.17 mg/mL、0.62 mg/mL。該多糖清除DPPH自由基的能力要強(qiáng)于清除羥自由基的能力。

2.8 黑松露多糖的降血糖活性

多糖類物質(zhì)可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)消化酶活性、調(diào)節(jié)肝臟糖代謝中關(guān)鍵酶表達(dá)等途徑達(dá)到降血糖作用[15]。攀枝花黑松露多糖對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，其抑制作用隨濃度的變化趨勢(shì)與阿卡波糖一致（圖8）。且該黑松露多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)于對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。在 2.5 mg/mL時(shí)對(duì)α-淀粉酶的抑制作用最大，達(dá)到 45.80%；在 2 mg/mL時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用趨于穩(wěn)定，達(dá)到57.22%。

曾有研究表明，多糖的降血糖活性與其分子質(zhì)量、單糖組成相關(guān)，一般在合適的范圍內(nèi)，分子量越低的多糖組分對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果越高[17]。有時(shí)，降血糖能力的強(qiáng)弱也與多糖的來(lái)源相關(guān)[19]，如邵淑宏等[29]的研究中測(cè)定了三種烏龍茶多糖，其中分子量最大的多糖具有最強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制效果。測(cè)定該多糖與阿卡波糖抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶IC50值：多糖的IC50值分別為1.99 mg/mL、3.30 mg/mL，阿卡波糖的IC50值分別為0.90 mg/mL、0.76 mg/mL。故黑松露多糖具有一定的降血糖能力，但與阿卡波糖相比，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶較弱。

3 結(jié)論

本研究在對(duì)黑松露多糖的結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，該組分具有糖類化合物的特征峰，且推斷出該多糖為α-吡喃型雜多糖，其分子量為1.29×104u，主要由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖組成，摩爾比為2.89:1.81:0.34:0.50?？寡趸徒笛墙Y(jié)果表明，該多糖具有較好的抗氧化和降血糖活性，且隨質(zhì)量濃度的增加其清除率和抑制率逐漸升高，其中對(duì)DPPH自由基的清除能力最好。黑松露多糖作為天然的抗氧化劑，在健康食品的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中具有一定的研究意義。同時(shí)，隨著對(duì)多糖研究的不斷深入，黑松露多糖較好的降血糖活性也將為其深度開(kāi)發(fā)及其在輔助治療糖尿病方面提供更好的健康解決途徑。