舒肝寧注射液對于氯丙嗪引起的新型組織工程肝構(gòu)建的膽汁淤積型藥物性肝損傷模型的影響

黃 龍，陳 煜，吳 橋,2，段鐘平

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 a.肝病中心四科；b.肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室， 北京 100069；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 感染中心，北京 100070

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是臨床常見的藥物不良反應(yīng)，是藥物研發(fā)失敗和撤市的重要因素，膽汁淤積型和混合肝細胞/膽汁淤積型損傷構(gòu)成DILI的兩種主要亞型，可能占所有DILI病例的50%[1]，藥物引起的膽汁淤積臨床可表現(xiàn)為瘙癢、乏力、尿色加深和黃疸等[2]。目前，膽汁淤積的臨床治療缺乏有效的藥物，僅有熊去氧膽酸和奧貝膽酸是可用于臨床且公認有一定療效的藥物，但其治療效果有限、個體差異大，且對于藥物引起的膽汁淤積的治療效果不理想。因此，開發(fā)新的膽汁淤積型肝損傷治療藥物十分必要，同時中藥在改善藥物引起的膽汁淤積(drug induced cholestatic，DIC)的作用方面受到越來越多的關(guān)注。舒肝寧注射液(Shuganning injection,SGN)是以茵陳提取物、梔子提取物、黃芩苷、板藍根提取物、靈芝提取物為原料，經(jīng)現(xiàn)代提取、精制而成的中藥注射劑，具有清熱解毒、利濕退黃、益氣扶正、保肝護肝的功效，是臨床上常用的退黃保肝藥物[3]。目前有大量臨床文獻報道其具有保肝和改善肝內(nèi)膽汁淤積的作用，但是其具體的退黃機制尚不明確。

藥物誘發(fā)膽汁淤積的機制是多種多樣的，且存在未知的因素。事實上，除了肝膽轉(zhuǎn)運蛋白[膽汁酸鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)/多藥耐藥蛋白2(MRP2)]的變化，其他機制例如損壞細胞骨架、氧化應(yīng)激等因素均可參與膽汁淤積的病理過程[4]。氯丙嗪(CPZ)屬于吩噻嗪類抗精神分裂癥藥物,有研究[5]表明CPZ引起膽汁淤積性肝損傷約占用藥者0.5%～1%，一般在用藥3周內(nèi)出現(xiàn)黃疸，停藥后3個月內(nèi)3/4患者可恢復(fù)。目前有研究[6]證明了CPZ可以抑制法尼醇X受體(FXR)表達，引起膽汁酸鹽過度生成，同時CPZ是膽鹽輸出泵BSEP的直接抑制劑，可以抑制膽汁酸鹽外排，進一步加劇膽汁酸鹽在肝細胞內(nèi)蓄積。除此之外CPZ引起的氧化應(yīng)激早期可加重膽汁淤積[7]，CPZ所致肝細胞膽汁淤積的臨床表現(xiàn)、發(fā)病特征，與其他特異質(zhì)肝毒性(ILT)的表現(xiàn)形式一樣，具有不可預(yù)測性、發(fā)生率低等特點[8]。本研究首先建立CPZ致膽汁淤積模型，由于新鮮的人肝細胞的來源有限，作者使用了表達1期和2期藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的分化人 HepG2細胞系，并在體外通過對天然獲取的大鼠脫細胞支架進行再細胞化在體外建立新型3D組織工程(tissue engineering，TE)肝臟，在此基礎(chǔ)之上加入CPZ及膽汁酸鹽混合物(使用時需稀釋1000倍)構(gòu)建DIC模型，分析CPZ治療引起的肝內(nèi)膽汁淤積的特征，探索舒肝寧對CPZ誘導(dǎo)的DIC保護作用。

1 資料與方法

1.1 試劑 DMEM購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購自美國Gibco公司；PCR提取試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AWV)。SGN由貴州瑞和制藥有限公司提供。蠕動泵購自Master-Flex、0.22 μm濾器(millex-GV)、SDC購自VETEC、一次性靜脈留置針(泰爾茂Hybria Ⅱ B型三通)、CCK8試劑盒購自DOJINDO公司、ROS檢測試劑盒(上海碧云天)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒以及谷胱甘肽(GSH)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒以及AKP測試盒均購自南京建成生物工程研究所。CPZ和波生坦(BOS)購自MCE(MedChemExpress)公司。膽汁酸混合物的組成和相應(yīng)的濃度見表1。

表1 1000×的混合膽汁酸鹽配方表

1.2 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠12只(體質(zhì)量180～220 g)來自斯貝福實驗動物中心，實驗前動物正常飼養(yǎng)。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.3 方法

1.3.1 DILI肝臟脫細胞支架的制備 大鼠提前24 h禁食，提前4 h禁水。大鼠用10%水合氯醛麻醉，消毒后打開腹腔，暴露肝臟及門靜脈，將靜脈留置針從門靜脈進針，固定后，開啟蠕動泵，流速20 mL/min～15 mL/min，沖洗約20 min。隨后序貫性泵入2% PLA2酶10 min，預(yù)冷的生理鹽水20 min，緊接著將整個肝臟摘取下來，盡量保證摘取肝臟的完整。隨后將大鼠肝臟支架結(jié)扎、修剪并保留肝中葉，放置于事先裝好DMEM的無菌異形瓶內(nèi)，連接蠕動泵裝置，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中循環(huán)灌流過夜。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及模型構(gòu)建 將高分化的HepG2細胞于DMEM培養(yǎng)基(加入10%牛胎血清和5%雙抗)中培養(yǎng)。每個支架以7 mL/min分3次接種，每次1×107個細胞，共3000萬個HepG2細胞，所選擇的灌注速率是基于成年大鼠靜止期間肝臟血流速度(85 mL·min-1·kg-1)；再細胞化完成后開始連續(xù)3 d每天在異形瓶中加入100 mL DMEM以及100 μL配置好的1000×膽汁酸鹽配方對培養(yǎng)基進行換液；再細胞化后的肝臟培養(yǎng)3 d后可進行造模，損傷組于第5天加入10 mmol/L CPZ蠕動泵循環(huán)培養(yǎng)24 h后構(gòu)建膽汁淤積性體外模型。損傷保護組于再細胞化后第4天提前加入SGN進行保護，24 h后于再細胞化后第5天加入CPZ再培養(yǎng)24 h，損傷組和損傷保護組均在加入CPZ藥物24 h后把肝臟取出，換藥前上清和換藥后上清送檢(圖1)。

圖1 制備CPZ所致膽汁淤積型肝損傷及藥物干預(yù)流程

1.3.3 細胞毒性檢測 CCK8將HepG2細胞制成40～60個/μL的細胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μL的細胞懸液。培養(yǎng)24 h，向平面培養(yǎng)板加入不同濃度(103、104、105、106、107、108稀釋液)的SGN，作用24 h后根據(jù)試劑說明書要求，向每孔加入10 μL CCK8溶液，將96孔板放在細胞孵養(yǎng)箱培養(yǎng)20 min，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)，并計算細胞增殖-毒性。

1.3.4 活性氧(ROS)檢測 將下機后的肝臟在圓皿中充分研磨，加入10 mL PBS溶液收集研磨下來的細胞，放入15 mL離心管中，2000 r/min離心10 min，離心兩次后棄掉上清收集細胞，加入500 μL PBS和0.5 μL熒光探針DCFH-DA，放入水浴鍋中37 ℃孵育40 min，用PBS溶液洗滌兩次，加入200 μL PBS混勻,用熒光酶標(biāo)儀480 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長測定結(jié)果。計算細胞中的ROS數(shù)據(jù)。

1.3.5 GSH測定 將肝臟研磨后，收集研磨后的細胞，加入10 mL PBS，離心后使用PBS清洗1～2次后再次離心收集沉淀細胞，再加入0.3～0.5 mL 0.1 mol/L pH值7.4的等滲PBS緩沖液懸浮細胞，手動研磨破碎細胞，細胞充分破碎后取破碎后的細胞懸液0.1 mL加0.1 mL的試劑盒中的試劑一混勻，3500 r/min，離心10 min，取上清液待測。根據(jù)試劑盒說明書，在96孔板加樣，混勻靜置5 min后用酶標(biāo)儀405 nm處測定各孔吸亮度值，計算細胞中GSH的含量。

1.3.6 SOD測定 將肝臟研磨后，收集研磨后的細胞加入10 mL OBS，離心1000 r/min，10 min，棄上清留沉淀細胞，在細胞沉淀中加入一定量的緩沖液PBS，用手動玻璃勻漿器冰水浴研磨3～5 min，準(zhǔn)備好樣品后根據(jù)試劑盒說明書，在96孔板中加樣，混勻后，37 ℃孵育20 min，在波長450 nm，酶標(biāo)儀測定吸亮度，計算細胞中SOD的含量。

1.3.7 AST、ALT、LDH、ALP試劑盒檢測上清 將肝臟下機后異型瓶中的上清液收集，根據(jù)南京建成上清試劑盒的檢測說明書于96孔板中加樣，再根據(jù)說明書中要求的波長條件于酶標(biāo)儀中測定各樣本的OD值，通過計算換算測定出樣品中的數(shù)值。

1.3.8 RT-qPCR及Western Blot檢測 RT-PCR:用Trizol提取總RNA，稀釋后紫外分光光度計，計算RNA濃度，然后用DNase處理。使用TakaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄后在ABI SteOnePlus機器上運行qPCR，所用引物見表2。

表2 PCR引物序列

Western Blot 檢測:收集上述各組細胞，提取細胞總蛋白，以 BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。通過配膠、上樣、轉(zhuǎn)膜這些過程后，用TBST和奶粉以5%的比例配置10 mL封閉液，搖床40 r/min，常溫在搖床封閉1 h或者在搖床4 ℃進行封閉過夜。之后將抗體按照實驗所需濃度配置好，將已經(jīng)封閉好的PVDF膜放入一抗中，將搖床調(diào)到40 r/min，4 ℃搖床孵育過夜。第二天加入10 mL TBST洗膜液，90 r/min，5 min。重復(fù)3次，緊接著將PVDF膜洗完后，將其放入配置好的二抗中，搖床轉(zhuǎn)速40 r/min，在室溫進行1 h孵育。再加入10 mL TBST洗膜液，90 r/min，5 min。再次重復(fù)3次。最后按照1∶1的比例將顯影液配好，PVDF膜放在塑封膜上，吸干表面殘存的液體。在PVDF膜上涂上顯影液，然后放入顯影儀中成像。

2 結(jié)果

2.1 DILI模型的建立 再細胞化后的組織工程肝臟在孵箱中用蠕動泵持續(xù)灌注。正常培養(yǎng)的組織工程肝臟用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，7 d后觀察CPZ損傷組和正常對照組(圖2)。

注：a，CPZ損傷組；b，正常對照組。

2.2 SGN的細胞毒性和保護作用 用平面96孔板的方法檢測了SGN的細胞毒性，使用不同濃度的SGN，SGN均無明顯的細胞毒性(圖3a)，進一步在加入CPZ損傷的情況下觀察不同濃度SGN的保護作用，發(fā)現(xiàn)從105倍的稀釋濃度開始其保護作用呈劑量依賴性。說明SGN對細胞具有良好的保護性，選取保護作用最明顯的103倍稀釋濃度作為實驗用藥物濃度(圖3b)。

注：a，不同SGN濃度對細胞的毒性；b，不同濃度SGN對細胞的保護作用。S3，SNG稀釋103倍；S4，SGN稀釋104倍；S5，SGN稀釋105倍；S6，SGN稀釋106倍；S7，SGN稀釋107倍，S8，SGN稀釋108倍。與CPZ損傷組比較，*P<0.001，**P<0.000 1。

2.3 SGN對CPZ引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用 ROS結(jié)果顯示，當(dāng)受到藥物損傷時，SGN可以有效的減少細胞ROS的產(chǎn)生，從而對細胞產(chǎn)生保護作用。還原性GSH的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)細胞受到藥物損傷時，SGN可以有效的增加細胞內(nèi)GSH的含量，從而增加細胞的抗氧化作用。SOD的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)細胞受到藥物損傷時，SGN可有效的增加細胞內(nèi)SOD的含量，使得細胞抗氧化能力增加。丙二醛(MDA)結(jié)果顯示，當(dāng)受到藥物損傷時，SGN可以有效減少細胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生(圖4)。以上結(jié)果反映了SGN在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的保護作用。

2.4 SGN對CPZ引起的組織工程肝損傷的保護作用 通過HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SGN的保護作用下，細胞的損傷明顯減少，細胞的數(shù)量相對于損傷組有明顯的提高(圖5)。在上清液的各種指標(biāo)的檢測中，發(fā)現(xiàn)AST、ALT、LDH和ALP等反應(yīng)肝損傷程度的指標(biāo)中在加入SGN的保護組中均較損傷組有明顯的下降(圖6)，以上這些數(shù)據(jù)證明了SGN對于DIC型肝損傷模型具有較好的保護作用。

2.5 SGN對CYP7A1和CYP8B1表達的影響 RT-qPCR 的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入CPZ后，會引起CYP7A1和CYP8B1這兩種酶類的基因水平升高，而在加入SGN保護后則可以抑制這兩種酶的表達。Westeren Blot 的結(jié)果也說明了在SGN的保護作用下，CYP7A1/8B1的蛋白表達水平已發(fā)生降低(圖7)。

2.6 SGN對BSEP和MRP2表達及FXR和SHP核受體的影響 SGN可以增加BSEP和MRP2兩種轉(zhuǎn)運蛋白的表達，并激活FXR和SHP核受體。由圖8可見，CPZ損傷后，BSEP及MRP2的基因水平表達明顯降低，而加入了SGN進行保護后，BSEP及MRP2的mRNA表達水平顯著升高。在SGN的保護作用下，F(xiàn)XR和SHP兩種核受體的基因及蛋白表達水平較CPZ損傷組均顯著增加。

注：與CPZ損傷組比較，*P<0.001,**P<0.000 1。

注：a，正常組；b，CPZ損傷組；c，SGN+CPZ保護組。

注：與CPZ損傷組比較，**P<0.000 1。

注：與CPZ損傷組比較，*P<0.001,**P<0.000 1。

3 討論

DIC是一個重要的臨床問題，會導(dǎo)致藥物撤市及停產(chǎn)，造成重大的經(jīng)濟損失[6]。DIC的臨床前預(yù)測目前主要限于測量該化合物抑制BSEP的潛力。然而，DIC的表現(xiàn)通常是復(fù)雜的，多因素的。因此，需要新的體外測定法，其可在生理學(xué)相關(guān)的肝模型中全面評估化合物的膽汁淤積風(fēng)險，筆者團隊構(gòu)建了3D 組織工程肝膽汁淤積型DILI模型，該模型被證實與藥物性膽汁淤積患者早期的許多臨床表現(xiàn)相似，包括血清生化指標(biāo)ALT、AST、TBil、TBA及膽汁酸鹽譜的變化、白蛋白和尿素氮合成增加。由于模型采用人的肝細胞，因此種屬差異性小，是一種良好的DIC細胞模型。

注：與CPZ損傷組比較，*P<0.01,**P<0.000 1。

有越來越多的證據(jù)表明，在膽汁淤積性肝病中，核受體FXR在嚙齒動物和人類的肝臟損傷機制中發(fā)揮了重要作用[9]。FXR在生理性膽汁酸的合成、分泌和運輸中起著重要作用[10]。這些過程的FXR調(diào)節(jié)缺陷可能導(dǎo)致膽汁淤積和隨后的病理變化[11]。FXR通過酶調(diào)節(jié)膽汁酸合成的減少和其攝取。FXR作為膽汁酸代謝的重要調(diào)節(jié)劑，能夠激活另一種核轉(zhuǎn)錄受體SHP，激活后的SHP使CYP7A1和CYP8B1的表達受到抑制，從而限制膽汁酸合成[12-13]。大量研究聚焦在FXR的激活對肝細胞中膽酸鹽外排的影響：研究表明[14]肝臟FXR的激活能夠增加膽酸鹽外排型轉(zhuǎn)運體小管膜轉(zhuǎn)運蛋白BSEP和MRP2的表達，從而使得膽酸鹽外排量增加，達到降低細胞內(nèi)膽酸鹽濃度、緩解膽汁淤積的目的。

在目前的研究中，筆者使用了分化的人HepG2和大鼠脫細胞支架構(gòu)建組織工程肝，分析SGN對肝內(nèi)膽汁淤積的影響，并對其引發(fā)機制進行了探討，具體機制見圖9。膽汁酸的穩(wěn)態(tài)取決于肝細胞和腸細胞中的轉(zhuǎn)運蛋白。肝細胞中的BSEP和MRP2將膽汁酸排入膽管，這步是決定膽汁流量的主要因素[15]。許多研究表明[16-18]，BSEP是FXR的直接靶標(biāo)，但一些發(fā)現(xiàn)表明，共激活子對于BSEP和MRP2基因的激活是必不可少的。其他轉(zhuǎn)運蛋白基因，尤其是有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體(OSTα/β)，MRP2和多藥耐藥蛋白3(MDR3)也可以通過FXR直接激活。FXR主要通過SHP參與機體膽汁酸代謝調(diào)節(jié)。正常生理狀態(tài)下，肝細胞膽汁酸的代謝主要通過BSEP、MRP2兩種膽汁酸鹽輸出泵代謝，幫助肝細胞進行膽汁酸的代謝。在此次研究中，當(dāng)用CPZ進行藥物損傷時，CPZ組誘導(dǎo)了藥物性膽汁淤積使得BSEP和MRP2這兩種膽鹽輸出泵的內(nèi)化內(nèi)吞，更加加劇了膽汁酸鹽細胞內(nèi)蓄積。SGN可以通過激活FXR/SHP核受體，增加BSEP和MRP2的表達，減少了有毒膽汁酸鹽在細胞內(nèi)堆積，從而保護了細胞。也可能是SGN在膽汁淤積性DILI模型中發(fā)揮抗膽汁淤積作用的分子機制。

圖9 舒肝寧保護機制的示意圖

綜上所述，本研究表明SGN有明顯的抗膽汁淤積作用，其機制可能為SGN通過激活FXR/SHP核受體，促進了外排轉(zhuǎn)運蛋白BSEP和MRP 2的表達上調(diào)同時抑制了CYP7A1和CYP8B1兩種酶的分泌，最終降低肝內(nèi)膽汁酸的淤積情況，改善了膽汁淤積的嚴(yán)重程度，有望為臨床SGN的治療提供新的思路。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020年6月5日經(jīng)由北京佑安醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過，批號:AEEI -2020 -076，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：黃龍負責(zé)撰寫論文;吳橋負責(zé)課題設(shè)計，修改論文;陳煜、段鐘平負責(zé)提供寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。