長鏈非編碼RNA LNC01309對人肝癌細胞增殖和遷移能力的影響及作用機制

劉紅燕，李婧姣，路澤軍，劉詠真，溫居一,

1 安徽醫(yī)科大學 海軍臨床學院，合肥 230032；2 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心 腫瘤內(nèi)科，北京 100048

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是全球發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤。近年來肝癌的診斷和治療取得了較大進展，但晚期肝癌患者預(yù)后仍較差。目前肝癌的發(fā)病機制尚未完全闡明，深入分析肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制，將有助于發(fā)現(xiàn)新的肝癌診斷標志物和治療靶點。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在腫瘤形成過程中的表達機制頗受關(guān)注，已被公認參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，與肝癌亦關(guān)系密切[1-2]。

在人類基因組中，參與編碼蛋白質(zhì)的基因僅占2%，超過98%基因組不編碼蛋白質(zhì)，其基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[3]。根據(jù)其長度，可將ncRNA分為miRNA、snoRNA、piRNA和lncRNA等[4]。ncRNA中大多數(shù)為lncRNA，lncRNA的基因長度往往>200 bp，其開放閱讀框一般短于50～100 bp。根據(jù)lncRNA在基因組中與編碼蛋白質(zhì)基因的相對位置，可將其分成5類，即反義lncRNA、正義lncRNA、雙向lncRNA、基因內(nèi)lncRNA和基因間lncRNA[5]。隨著二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，成千上萬的lncRNA在脊椎動物和非脊椎動物體內(nèi)被快速鑒別出來。但是，二代測序技術(shù)在實際應(yīng)用中也存在很多缺陷，如文庫制備過程中PCR擴增很大程度會使后續(xù)結(jié)果出現(xiàn)誤差，而且盡管已經(jīng)開發(fā)出各種算法來提高測序結(jié)果的質(zhì)量，但其對于組裝一個橫跨整個基因組的長片段仍然是一項挑戰(zhàn)。lncRNA通常長度較長且存在多種剪接形式，單純的RNA-Seq并不能分辨各種異構(gòu)體，因此第三代測序技術(shù)的誕生就顯得尤為重要[6]。

PacBio作為最新一代的測序技術(shù)，是由美國Pacific Bioscience開發(fā)的單分子實時測序(molecule real time sequencing，SMRT)技術(shù)，測序過程無需PCR擴增。其在讀取長度方面遠超于二代測序技術(shù)，并且無GC偏好性，能夠大大提升基因組組裝的質(zhì)量[7]。PacBio在研究轉(zhuǎn)錄組學方面最大的優(yōu)勢在于它能夠獲得全長或接近全長的轉(zhuǎn)錄本，這對可變剪切的鑒定、lncRNA的分析[8-9]以及新基因的發(fā)現(xiàn)等研究有著重要意義；且能在原有研究基礎(chǔ)上進行補充甚至發(fā)現(xiàn)新的機制。

本研究主要利用PacBio三代測序技術(shù)在肝癌組織中鑒定新的lncRNA，并在肝癌細胞中進行功能機制的初步探索。

1 材料與方法

1.1 研究材料 收集2018年2月—2019年6月解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心12例肝癌患者的腫瘤組織和對應(yīng)的癌旁組織。人肝癌細胞系(Hep G2、SNU-398和Hep 3B)購自北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心；人永生化正常肝細胞(THLE-2)購自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI-1640及胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Smarter PCR cDNA合成試劑盒購自美國Clontech公司；SYBR Green染料購自日本Takara公司；所有引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；CNOT4、EIF4G2、HNRNPA1、MBNL1、RBM24、RBM6、SRSF10抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；RBM38、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自英國Abcam公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司；Transwell小室購自康寧公司；RNA熒光原位雜交(RNA fluorescence in situ hybridization，RNA FISH)和EdU檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；靶向lncRNA MIR205HG的siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計與合成；pCMV-RBM38購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；pEXP-LNC01309野生型和突變型表達載體由廣州銳博生物科技有限公司構(gòu)建完成。

1.2 細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染 按照培養(yǎng)基和血清配比為9∶1配置完全培養(yǎng)基；所有細胞均采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱為細胞培養(yǎng)環(huán)境。細胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 3000試劑。在6孔板中，接種細胞濃度為1×106/孔，培養(yǎng)基體積2 mL，其中siRNA用量為20 nmol/L/孔，質(zhì)粒用量為8 μg/孔，共孵育24 h后，進行后續(xù)試驗。

1.3 RNA提取 采用Trizol提取組織或細胞中的RNA。按100 mg組織加1 mL Trizol研磨，制備組織懸液；5×106細胞加入1 mL Trizol吹打，收獲細胞懸液；且冰上裂解5～10 min后，按200 μL氯仿﹕1 mL Trizol的比例加入氯仿，混勻液體，靜置15 min。然后4 ℃ 12 000 r/min離心分離RNA，吸取上清液至新的EP管中并棄去沉淀。加入等體積異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入75%酒精充分洗滌沉淀，離心去除上清液。最后將RNA樣品沉淀置于超凈臺干燥5 min，加入DEPC水溶解，Nanodrop測量總RNA濃度，并置于-80 ℃保存。

1.4 PacBio三代測序 利用Trizol提取組織RNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書，共使用4 μg混合RNA與Pacbio Sequel系統(tǒng)(Pacific Biosciences，CA，USA)進行全長轉(zhuǎn)錄序列測序。使用Clontech Smarter PCR cDNA合成試劑盒和Pacific Biosciences的luePippin Size Selection系統(tǒng)(PN100-092-800-03)，根據(jù)異構(gòu)體測序(Iso-Seq)協(xié)議制備Iso-Seq文庫。后續(xù)測序與分析由北京基石生命科技有限公司完成。

1.5 熒光定量PCR 按照試劑盒說明書使用寡(dT)引物在總體積為20 μL的條件下進行cDNA合成；采用染料法，使用最終體積為25 μL的500 ng cDNA模板進行熒光定量PCR。重復(fù)3次試驗，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下(5′-3′)，lncRNA MIR205HG：正向引物AGCAGCAGCAGCAAGAGTAA，反向引物GAAAGATTAAGGTTCCCATC；LNC01309：正向引物AGCAGCAGCAGCAAGAGTAACT，反向引物GAAAGATTAAGGTTCCCATC；RBM38：正向引物GCTACGGCTTCGTGACCAT，反向引物GTAAGTCCGCTGGATCAAGGT；GAPDH：正向引物AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反向引物AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

1.6 Western Blot 冰上裂解細胞并提取細胞中的總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，向50 μg蛋白樣品中加入等體積的2×Laemmli上樣緩沖液，總上樣體積為20 μL，進行SDS-PAGE電泳。接著進行恒流(200 mA)轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，4 ℃孵一抗過夜。次日進行二抗常溫孵育，二抗孵育完成后加入化學發(fā)光液與蛋白條帶反應(yīng)，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.7 細胞增殖檢測 使用CCK-8和EdU檢測細胞增殖。CCK-8檢測：按照1×104/孔細胞數(shù)接種至96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁生長覆蓋率達到50%左右，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染細胞并持續(xù)培養(yǎng)4 d。分別于不同時間點(0、24、48、72、96 h)棄去培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基配置的10% CCK-8反應(yīng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 min，酶標儀檢測波長在450 nm處的吸光度值。EdU檢測：細胞接種于96孔板中，經(jīng)轉(zhuǎn)染處理24 h。然后將50 μmol/L EdU加入培養(yǎng)孔，37 ℃孵育2 h后，用4%多聚甲醛固定細胞。按照標準程序，anti-EdU工作液和DAPI染色孵育細胞。于熒光顯微鏡(奧林巴斯IX71)下觀察，隨機選取不同視野記錄試驗結(jié)果。

1.8 細胞劃痕愈合試驗 將各組Hep G2細胞按1×106/孔接種于6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第2天用10 μL槍頭劃兩條平行線，形成劃痕。使用PBS輕輕漂洗2～3遍，加人無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、12 h觀察，拍照。用Image J分析遷移面積并計算遷移率。

1.9 Transwell遷移試驗 將轉(zhuǎn)染后24 h的各組細胞按照5×104細胞數(shù)分別接種于Transwell的上室，下室中加入800 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，采用PBS清洗3次，甲醇固定15 min，用DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察并隨機選取5個以上視野拍照計數(shù)。

1.10 RNA FISH 使用預(yù)冷的Triton X-100(0.1%)使細胞膜通透，并用多聚甲醛(4%)處理載玻片。然后用LNC01309探針雜交過夜。SCC緩沖液清洗細胞。采用DAPI染細胞核后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.11 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性測定 用終濃度100 μg/mL的放線菌酮處理細胞，并在指定時間點(0、2、4 h)收取細胞。從細胞中提取蛋白質(zhì)并進行蛋白質(zhì)印跡分析。β-肌動蛋白用作參照。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA LNC01309在肝癌組織和細胞中的表達 在肝癌和對應(yīng)的癌旁組織中利用PacBio測序分析發(fā)現(xiàn)1條高豐度且未見報道的lncRNA(圖1a)，長度為309 nt，暫命名為LNC01309。利用熒光定量PCR檢測分析，結(jié)果顯示肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織中LNC01309水平分別為4.225±2.285與1.541±0.530，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.618，P=0.004)(圖1b)。將永生化正常肝細胞(THLE-2)和多種肝癌細胞(Hep G2、SNU-398和Hep 3B)中的LNC01309表達情況進行比較，結(jié)果顯示，LNC01309在肝癌細胞中的相對含量分別為1.860±0.126、2.313±0.383和3.917±0.393，均明顯高于THLE-2細胞(1.011±0.074)(t值分別為4.231、6.489、14.480，P值分別為0.004、<0.001、<0.001)(圖1c)。

注：a，PacBio測序分析獲得的LNC01309序列；b，利用熒光定量PCR分析LNC01309在肝癌組織與癌旁組織中的表達差異；c，利用熒光定量PCR分析LNC01309在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達差異。

2.2 LNC01309與lncRNA MIR205HG的關(guān)系分析 利用NCBI BLAST進行序列比對分析，LNC01309定位于1號染色體(209432225-209432545)，與lncRNA MIR205HG存在較高的序列相似性(表1)。lncRNA MIR205HG亦定位于1號染色體(209428820-209432549)，其目前存在5種剪接體，通過序列比對分析，筆者設(shè)計了特異的PCR引物用于區(qū)分檢測lncRNA MIR205HG和LNC01309(圖2a)。結(jié)果顯示，lncRNA MIR205HG無論是在肝癌組織還是在肝癌細胞中均不存在異常表達現(xiàn)象(圖2b、c)。隨后，在Hep 3B肝癌細胞中利用siRNA敲降lncRNA MIR205HG，分為NC siRNA對照組(NC si)和MIR205HG siRNA處理組(MIR205HG si)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著lncRNA MIR205HG的下調(diào)(1.001±0.082 vs 0.281±0.062，t=15.690，P<0.001)(圖2d)，LNC01309并未明顯下降(1.008±0.046 vs 1.075±0.085，t=1.534，P=0.164)(圖2e)。值得注意的是，LNC01309本身序列中并不含有miR-205序列，因此在肝癌細胞中過表達LNC01309，分為質(zhì)粒對照組(pEXP-control)和過表達組(pEXP-LNC01309)(1.006±0.099 vs 27.350±5.744，t=9.172，P<0.001)并沒有導(dǎo)致miR-205相對含量的變化(0.971±0.083 vs 0.962±0.100，t=0.142，P=0.892)(圖2f、g)。

表1 利用NCBI BLAST比較LNC01309與lncRNA MIR205HG序列相似性

2.3 LNC01309促進肝癌細胞增殖與遷移 筆者嘗試在含有較低豐度LNC01309的Hep G2細胞中過表達LNC01309(1.006±0.099 vs 27.350±5.744，t=9.172，P<0.001)。RNA FISH試驗結(jié)果與在線工具Locate-R(http://locate-r.azurewebsites.net/)預(yù)測結(jié)果相一致，LNC01309主要定位于細胞質(zhì)中(圖3、4)。隨著LNC01309水平的升高，肝癌細胞的增殖能力(第96小時OD450值：1.885±0.107 vs 2.527±0.234，t=4.330，P=0.012)顯著上調(diào)(圖5、6)。同時，劃痕愈合試驗(11.65%±2.40% vs 35.66%±4.90%，t=9.837，P<0.001)(圖7)和Transwell試驗結(jié)果(100.00%±3.11% vs 161.00%±35.93%，t=4.399，P=0.005)(圖8)均顯示肝癌細胞遷移能力增強。Western Blot結(jié)果顯示，過表達LNC01309會促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標志蛋白N-cadherin(0.466±0.067 vs 1.253±0.046，t=5.322，P=0.009)和Vimentin(0.372±0.126 vs 2.638±0.413，t=7.292，P=0.018)的表達，同時下調(diào)E-cadherin的表達(0.909±0.032 vs 0.151±0.014，t=50.450，P<0.001)(圖9)。

注：a，LNC01309與lncRNA MIR205HG序列相似性，并根據(jù)序列差異性設(shè)計特異性檢測引物；b，利用熒光定量PCR分析lncRNA MIR205HG在肝癌組織與癌旁組織的表達差異；c，利用熒光定量PCR分析lncRNA MIR205HG在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達差異；d、e，Hep 3B細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA(20 nmol/L)處理24 h后，利用熒光定量PCR分別檢測lncRNA MIR205HG和LNC01309的相對表達含量；f、g，Hep G2細胞中轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒24 h后，利用熒光定量PCR分別檢測LNC01309和miR-205的相對表達含量。

圖3 在線工具Locate-R預(yù)測LNC01309的細胞定位

注：Hep G2細胞中轉(zhuǎn)染LNC01309表達質(zhì)粒以及對照質(zhì)粒(24孔板中使用量為1 μg/孔)處理，于不同時間點利用CCK-8檢測細胞活性。

圖6 EdU染色試驗檢測轉(zhuǎn)染LNC01309表達質(zhì)粒的Hep G2細胞增殖

圖7 細胞劃痕試驗檢測轉(zhuǎn)染LNC01309表達質(zhì)粒的Hep G2細胞的遷移能力

圖8 Transwell檢測轉(zhuǎn)染LNC01309表達質(zhì)粒的Hep G2細胞的遷移能力

圖9 Western Blot檢測各組細胞中EMT標志蛋白的相對含量

2.4 LNC01309與RNA結(jié)合蛋白的相互作用 利用在線工具RBPmap(http://rbpmap.technion.ac.il/index.html)和catRAPID(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)分析LNC01309的潛在結(jié)合蛋白，獲得了CNOT4、EIF4G2、HNRNPA1、MBNL1、RBM24、RBM38、RBM6和SRSF10共8個排名靠前的候選蛋白(表2)。隨后，在Hep G2細胞中過表達LNC01309，利用候選蛋白的特異抗體進行RNA免疫共沉淀試驗，富集結(jié)果分別為0.087±0.044、0.120±0.107、0.192±0.105、0.164±0.093、0.153±0.108、0.502±0.213、0.124±0.085和0.168±0.068；與IgG對照組比較，僅RBM38抗體組差異有統(tǒng)計學意義(0.502±0.213 vs 0.060±0.029，t=3.846，P=0.031)(圖10a)。將RBM38潛在結(jié)合位點(gugugcg)

表2 利用RBPmap和catRAPID在線預(yù)測能夠與LNC01309結(jié)合的潛在靶標蛋白

缺失突變后構(gòu)建突變型LNC01309。RNA免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，與IgG對照組比較，RBM38抗體組沉淀富集的野生型LNC01309相對含量顯著升高(0.434±0.122 vs 0.034±0.017，t=5.123，P=0.036)，而突變型LNC01309在兩組中的沉淀富集豐度差異無統(tǒng)計學意義(0.077±0.051 vs 0.031±0.006，P=0.201)(圖10b)。

注：a，利用潛在RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體進行RNA-IP試驗，熒光定量PCR檢測LNC01309的富集豐度；b，熒光定量PCR比較RBM38的抗體對野生型和突變型LNC01309的富集豐度差異。

2.5 LNC01309影響RBM38蛋白穩(wěn)定性 在相對低表達LNC01309的Hep G2細胞中過表達LNC01309時，并不會影響RBM38 mRNA的相對表達量(1.022±0.074 vs 0.953±0.076，P=0.185)，但會降低RBM38蛋白的相對含量(0.960±0.057 vs 0.228±0.044，t=5.526，P=0.008)(圖11)。利用放線菌酮處理Hep G2細胞，LNC01309過表達組細胞中RBM38蛋白的穩(wěn)定性顯著低于對照質(zhì)粒組(第4小時相對蛋白含量：0.610±0.075 vs 0.179±0.054，t=8.038，P=0.001)(圖12、13)。此外，過表達的RBM38能夠有效抑制LNC01309的促細胞增殖能力(第96小時OD450值：2.500±0.227 vs 1.913±0.282，t=2.812，P=0.048)(圖14)。細胞劃痕愈合試驗結(jié)果(30.69%±5.80% vs 16.37%±1.66%，t=6.218，P<0.001)(圖15)和Transwell試驗結(jié)果(168.00%±9.43% vs 117.20%±18.03%，t=6.622，P<0.001)(圖16)均顯示過表達的RBM38能夠有效抑制LNC01309誘導(dǎo)的肝癌細胞遷移能力的上調(diào)。

圖11 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染LNC01309表達質(zhì)粒的Hep G2細胞24 h后RBM38蛋白的相對表達含量

圖12 Western Blot檢測不同時間點經(jīng)放線菌酮處理轉(zhuǎn)染LNC01309表達質(zhì)粒的Hep G2細胞中的RBM38蛋白相對含量

圖13 不同時間點檢測經(jīng)放線菌酮處理轉(zhuǎn)染LNC01309表達質(zhì)粒的Hep G2細胞中RBM38蛋白相對含量

注：Hep G2細胞中單獨轉(zhuǎn)染pEXP-LNC01309或者共轉(zhuǎn)染pCMV-RBM38質(zhì)粒24 h后，于不同時間點利用CCK-8檢測各組細胞活性。

圖15 細胞劃痕愈合試驗檢測各組轉(zhuǎn)染HepG2細胞的遷移能力

圖16 Transwell檢測各組轉(zhuǎn)染Hep G2細胞的遷移能力

3 討論

大量的研究[10-12]工作已經(jīng)證實lncRNA與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。例如，lncRNA ATB競爭性地結(jié)合miR-200，進而激活ZEB1和ZEB2的表達；ZEB1和ZEB2與IL-11 mRNA的相互作用增強了Stat3信號，促進肝癌轉(zhuǎn)移，加速器官受累[13]。lncRNA HULC在肝癌中異常高表達[14]，能夠介導(dǎo)腫瘤抑制因子P18的下調(diào)，可促進肝癌的細胞增殖[15]。lncRNA HOTAIR降低

了CREB、P300、RNApoⅢ在SETD2啟動子區(qū)域的重新分配，從而抑制了SETD2的表達和磷酸化，借此促進人類肝癌干細胞的惡性生長[16-17]。目前發(fā)現(xiàn)lncRNA主要有以下幾個方面的調(diào)控功能[18-19]。(1)表觀遺傳學：通過干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合、誘導(dǎo)蛋白質(zhì)修飾和染色質(zhì)發(fā)生重構(gòu)等方式影響編碼基因表達；(2)轉(zhuǎn)錄調(diào)控：與靶蛋白結(jié)合后影響基因轉(zhuǎn)錄；(3)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：能調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯進程，作用蛋白結(jié)合伴侶或調(diào)節(jié)蛋白的亞細胞定位影響蛋白活性等，進而影響腫瘤進展[20]；(4)編碼微肽：lncRNA重新獲得編碼能力，產(chǎn)生具有功能的微肽[21]。筆者通過PacBio測序分析LNC01309顯示，在肝癌組織和肝癌細胞中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。后續(xù)的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)LNC01309能夠與RBM38蛋白發(fā)生相互作用，并借此下調(diào)RBM38蛋白穩(wěn)定性。

RBM38是一種RNA結(jié)合蛋白，在正常細胞中通過調(diào)控RNA參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而影響細胞增殖、細胞周期循環(huán)、肌源性分化等多種生物學過程。目前已知RBM38可與p53、mdm2、p63、p73、p21、c-Myc和MIC-1等多個目的基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)mRNA的穩(wěn)定性，從而在腫瘤進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22-27]?，F(xiàn)有研究[28]顯示，RBM38可能通過穩(wěn)定p53-mdm2環(huán)抑制肝癌的發(fā)生。p53-mdm2通路在肝癌中經(jīng)常發(fā)生改變，mdm2和p53基因突變可增加mdm2的穩(wěn)定性，加速p53降解，破壞p53-mdm2平衡，從而誘導(dǎo)癌變，最終促進肝癌發(fā)生。Ye等[28]報道RBM38作為穩(wěn)定p53-mdm2環(huán)的重要分子，在肝癌組織中RBM38失活，而mdm2表達增加，野生型p53表達隨之降低，最終破壞p53-mdm2環(huán)的平衡；相反，若增加RBM38表達則可抑制肝癌細胞mdm2的表達，恢復(fù)野生型p53的表達，從而在體外抑制肝癌細胞遷移和侵襲；裸鼠體內(nèi)實驗也顯示RBM38對肝癌的體內(nèi)致瘤性具有一定抑制作用。以上體內(nèi)外研究結(jié)果表明，上調(diào)RBM38可能通過抑制mdm2從而拯救野生型p53，進而改變肝癌的生物學功能和進展。本研究結(jié)果表明RBM38能夠與野生型LNC01309發(fā)生結(jié)合作用，而不能夠結(jié)合突變型LNC01309。LNC01309通過與RBM38的相互作用降低RBM38的蛋白穩(wěn)定性，促進肝癌細胞的惡性表型特征。

LNC01309與lncRNA MIR205HG具有較高的序列相似性。然而敲降已知的lncRNA MIR205HG不同剪接體，并不會改變LNC01309的相對含量。這些結(jié)果提示，LNC01309并不是已知lncRNA MIR205HG的再加工形式或者降解片段，其可能是MIR205HG基因初始轉(zhuǎn)錄本的另一種剪接體形式。已知的lncRNA MIR205HG在肝癌組織和肝癌細胞中并不存在異常表達現(xiàn)象，這也是與LNC01309最大的區(qū)別。

LNC01309在肝癌細胞中主要定位于細胞質(zhì)。由于lncRNA通常會作為內(nèi)源性RNA海綿與miRNA作用并影響miRNA的表達與功能，而lncRNA定位于細胞質(zhì)是這一功能發(fā)揮的前提條件，因此LNC01309理論上存在參與調(diào)控miRNA表達與功能的潛質(zhì)，這也是后續(xù)應(yīng)開展的研究方向。

綜上，本研究團隊依賴于肝癌組織的PacBio測序分析獲得一條全新lncRNA LNC01309，在肝癌細胞中進行了相關(guān)功能探索，初步證明LNC01309通過與RBM38相互作用降低了RBM38的蛋白穩(wěn)定性，促進肝癌細胞的增殖與遷移。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉紅燕參與課題設(shè)計，完成試驗，文章寫作；李婧姣、路澤軍、劉詠真參與試驗、收集和分析數(shù)據(jù)及修改文章；溫居一負責研究方案總體規(guī)劃設(shè)計，指導(dǎo)撰寫文章及論文修改。