囊胚發(fā)育速度和形態(tài)學(xué)參數(shù)與整倍體狀態(tài)及妊娠結(jié)局的相關(guān)性

陳夢(mèng)茜，王瑩，周林，曹善仁，武恂，凌秀鳳，張軍強(qiáng)

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210004)

自1978年第一位試管嬰兒誕生至今，輔助生殖技術(shù)經(jīng)歷了高速發(fā)展的40余年，其培養(yǎng)條件及操作技術(shù)日益完善，成功率日趨穩(wěn)定。近年來，隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展成熟及玻璃化冷凍技術(shù)的完善，為胚胎復(fù)蘇移植創(chuàng)造了充分條件。如今，輔助生殖技術(shù)已經(jīng)從以往的追求成功率向注重母體和子代的長(zhǎng)遠(yuǎn)健康轉(zhuǎn)變，單囊胚移植在獲得較理想的臨床妊娠率的同時(shí)可以有效降低多胎妊娠率和流產(chǎn)率[1]，實(shí)行單胚胎移植已逐漸受到大眾的認(rèn)可。因此，如何選擇真正具有發(fā)育潛能的胚胎移植成為需要解決的關(guān)鍵問題之一[2-4]。當(dāng)前的臨床工作中，普遍優(yōu)先選擇受精后發(fā)育至第5天即形成囊胚，且形態(tài)學(xué)評(píng)分高的胚胎進(jìn)行移植，但是，當(dāng)形態(tài)學(xué)評(píng)分和發(fā)育時(shí)間相互沖突時(shí)，如何選擇優(yōu)先移植的胚胎尚存在爭(zhēng)議[5-6]。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要包括：胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)，即對(duì)于高齡、反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不良孕產(chǎn)史等患者做胚胎整倍體篩查；植入前結(jié)構(gòu)重排基因檢測(cè)，即針對(duì)夫妻雙方中有一方或雙方存在染色體異常，如平衡易位等，檢測(cè)其胚胎是否具有染色體結(jié)構(gòu)異常；胚胎植入前單基因遺傳學(xué)檢測(cè)，即檢測(cè)胚胎是否有一些可造成單基因病的遺傳基因。PGT-A操作復(fù)雜、昂貴且有創(chuàng)，并且有嚴(yán)格的適應(yīng)證；目前，國內(nèi)僅有少量中心有資質(zhì)開展PGT-A。傳統(tǒng)的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估方法操作便捷、簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)且無創(chuàng)，是最常規(guī)的評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育潛能的方法。如果將兩者結(jié)合，利用傳統(tǒng)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分的各個(gè)關(guān)鍵參數(shù)來探索胚胎的整倍體性及后續(xù)發(fā)育潛能，有望在囊胚移植時(shí)更精準(zhǔn)地優(yōu)選胚胎。因此，本研究擬在行PGT-A的患者中，研究囊胚發(fā)育速度及形態(tài)學(xué)評(píng)分與囊胚整倍體性及妊娠結(jié)局的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2017年10月至2021年1月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行PGT-A助孕的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合PGT-A指征；至少有1枚囊胚進(jìn)行活檢并且送檢；排除標(biāo)準(zhǔn)：夫妻雙方中有一方或兩方存在染色體異常；行胚胎植入前單體型連鎖分析技術(shù)患者；因單基因病行胚胎植入前單基因遺傳學(xué)檢測(cè)患者。

1.2 促排卵方案及授精方式

根據(jù)患者個(gè)體情況采用相應(yīng)的促排卵方案進(jìn)行促排卵，取卵日行超聲引導(dǎo)下卵泡穿刺術(shù)。所有PGT-A周期均采用卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射進(jìn)行授精。卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射后置于G1 plus培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife公司)中進(jìn)行培養(yǎng)，受精后16～18 h觀察并記錄受精情況；雙原核為正常受精。

1.3 胚胎培養(yǎng)

待胚胎發(fā)育至第3天時(shí)觀察胚胎的卵裂情況；將全部可用胚胎置于G2 plus培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife公司)中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。

1.4 囊胚觀察與活檢

囊胚評(píng)估采用Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行評(píng)分，分別在第5、6、7天進(jìn)行觀察，選擇囊胚擴(kuò)張程度為4期及以上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分在B級(jí)以上，滋養(yǎng)層評(píng)分在C級(jí)以上的囊胚進(jìn)行活檢。囊胚活檢時(shí)，在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處用激光對(duì)透明帶打孔，用活檢針緩緩吸入4～5枚滋養(yǎng)層細(xì)胞，激發(fā)3～4次激光切割細(xì)胞連接最薄弱處，使目標(biāo)滋養(yǎng)層細(xì)胞與囊胚分離；將取下的細(xì)胞置于PCR管中備檢，活檢細(xì)胞行遺傳學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)方法為二代測(cè)序；囊胚活檢后按每管一枚胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍。

1.5 胚胎移植及隨訪

子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案包括自然周期方案及人工周期方案，排卵或黃體轉(zhuǎn)化后第5天行囊胚移植。根據(jù)PGT-A檢測(cè)結(jié)果，選擇可移植囊胚進(jìn)行單囊胚解凍移植，術(shù)后給予常規(guī)黃體支持。移植后14 d測(cè)血人絨毛膜促性腺激素，移植后28 d行超聲檢查，見孕囊及監(jiān)測(cè)到胎心即為臨床妊娠。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

共納入173例患者的237個(gè)PGT-A周期；共活檢1 026枚胚胎，其中51枚因擴(kuò)增失敗、無檢測(cè)信號(hào)或結(jié)果無法判讀而未得到整倍體狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果。在剩余975枚囊胚中，整倍體囊胚為479枚(49.13%)，非整倍體囊胚為496枚(50.87%)。截至2021年1月31日，237個(gè)PGT-A周期中，除48個(gè)周期無可移植胚胎外，已完成127個(gè)周期胚胎移植。

2.2 囊胚發(fā)育速度、擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層級(jí)別對(duì)囊胚整倍體率的影響

與第5天胚胎相比，第6、7天形成胚胎整倍體率顯著降低(P<0.001)，調(diào)整年齡后，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；與4期囊胚相比，5期及6期囊胚整倍體率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061，0.113)，調(diào)整年齡后，差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.132，0.109)；與囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)A級(jí)別相比，B級(jí)別整倍體率顯著降低(P<0.001)，調(diào)整年齡后，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；囊胚滋養(yǎng)層B級(jí)別與A級(jí)別相比，整倍體率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.373)，調(diào)整年齡后差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.233)；滋養(yǎng)層C級(jí)別與A級(jí)別相比，囊胚整倍體率顯著降低(P=0.001)，調(diào)整年齡后差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。見表1。

表1 囊胚發(fā)育速度和形態(tài)學(xué)參數(shù)與其整倍體率的關(guān)系

2.3 囊胚發(fā)育速度、擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層級(jí)別對(duì)妊娠結(jié)局的影響

共完成整倍體單囊胚移植127個(gè)周期，其中第5天移植68個(gè)，第6天移植57個(gè)，第7天移植2個(gè)。調(diào)整年齡前，臨床妊娠率在不同囊胚形成時(shí)間組、不同囊胚擴(kuò)張程度組、不同內(nèi)細(xì)胞團(tuán)級(jí)別組、不同滋養(yǎng)層細(xì)胞組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

調(diào)整年齡因素后，在整倍體囊胚中，不同發(fā)育速度的胚胎間臨床妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.498)；與移植4期囊胚相比，移植5期、6期囊胚后臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.377，0.550)；與囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)A級(jí)別相比，移植B級(jí)別囊胚后臨床妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.618)；與囊胚滋養(yǎng)層A級(jí)別相比，B、C級(jí)別臨床妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.740，0.995)。見表2。

表2 囊胚發(fā)育速度和形態(tài)學(xué)參數(shù)與臨床妊娠率的關(guān)系

3 討論

既往研究表明[8-9]，PGT-A整倍體率隨女方年齡增長(zhǎng)而下降，在女方年齡大于35歲后，下降更為明顯；另外，女方年齡是影響妊娠結(jié)局的決定性因素。本研究中，有95個(gè)活檢周期女方年齡大于35歲，因此，將女方年齡作為首要調(diào)整因素納入分析。

國內(nèi)外有多項(xiàng)研究表明，囊胚擴(kuò)張程度與整倍體率顯著相關(guān)，2016年意大利一項(xiàng)研究顯示[10]，與1～2期囊胚整倍體率(5.1%)相比，5～6期囊胚整倍體率顯著提高(81.1%，P=0.026)；2018年美國一項(xiàng)研究表明[11]，5～6期囊胚整倍體率(48.8%)顯著高于3～4期囊胚(32.2%，P<0.01)。上述國外研究的囊胚擴(kuò)張程度都按1～2期、3～4期、5～6期分組，而國內(nèi)大多將囊胚培養(yǎng)至4期以上才進(jìn)行活檢。申春艷等[12]研究中4期囊胚占比為90.2%，本研究中4期囊胚占比為88.3%(861/975)，與其相一致，但4期與5期、6期囊胚數(shù)量相差懸殊，因此導(dǎo)致相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

關(guān)于胚胎發(fā)育速度與整倍體率的關(guān)系，目前的研究呈現(xiàn)兩種不同的結(jié)果，有研究表明胚胎發(fā)育速度與整倍體率無明顯相關(guān)[10, 13]，也有研究表明第6、7天活檢的囊胚整倍體率較第5天低[14-15]；本研究結(jié)果與后者一致，這可能與選擇標(biāo)準(zhǔn)的不同相關(guān)，即本研究嚴(yán)格要求囊胚在發(fā)育到4期才會(huì)進(jìn)行活檢，而部分研究在第4天即開始活檢，且未要求發(fā)育至4期。另外，有研究結(jié)合時(shí)差成像系統(tǒng)觀察數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示非整倍體胚胎發(fā)育速度更慢[15]。目前臨床研究表明，移植第5天囊胚的妊娠率明顯高于第6天。研究表明，一些導(dǎo)致胚胎非整倍體的因素，如線粒體或基因表達(dá)缺陷、線粒體DNA含量低、紡錘體異常等，都會(huì)表現(xiàn)為胚胎發(fā)育速度緩慢[16-18]。結(jié)合中心質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)及既往基礎(chǔ)和臨床研究[19]，南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心在實(shí)際工作中，會(huì)選擇優(yōu)先移植第5天的囊胚，以期獲得更好的妊娠結(jié)局。

本研究結(jié)果顯示，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞級(jí)別對(duì)整倍體率有顯著影響；內(nèi)細(xì)胞團(tuán)B級(jí)別的囊胚整倍體率顯著低于A級(jí)別；C級(jí)別滋養(yǎng)層細(xì)胞囊胚整倍體率顯著低于A級(jí)別，B級(jí)別滋養(yǎng)層細(xì)胞囊胚整倍體率雖低于A級(jí)別，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此優(yōu)質(zhì)囊胚的整倍體率高于非優(yōu)質(zhì)囊胚。國內(nèi)外研究均表明[15, 20-21]，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞級(jí)別與整倍體性顯著相關(guān)，級(jí)別高者更有可能是整倍體，本研究結(jié)果與其一致。因此，胚胎發(fā)育早期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞狀態(tài)可作為預(yù)測(cè)胚胎整倍體結(jié)果的重要參考。

對(duì)于高齡、反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不良孕產(chǎn)史等患者，PGT-A均可有效改善妊娠結(jié)局[22-24]；不同指征患者的整倍體率和臨床妊娠率均存在差異[24]，高齡患者較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者可獲得更高的胚胎整倍體率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率[25]。在PGT-A患者中，對(duì)于移植第5天和第6天的胚胎，兩者臨床妊娠率和早期流產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[10]；本研究中移植第5天和第6天的囊胚臨床妊娠率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此提示在整倍體胚胎中，胚胎發(fā)育速度對(duì)臨床妊娠的影響不大，第5天胚胎和第6天胚胎價(jià)值等同，這可以為PGT-A患者在選擇胚胎時(shí)提供參考。另外，本研究結(jié)果顯示，在不同的囊胚擴(kuò)張程度與不同級(jí)別的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)層細(xì)胞之間臨床妊娠率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于未行PGT-A檢測(cè)的患者，囊胚發(fā)育速度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)級(jí)別、滋養(yǎng)層細(xì)胞級(jí)別可作為確定胚胎移植順序的參考依據(jù)，囊胚擴(kuò)張程度不作為主要考慮因素，優(yōu)先選擇第5天、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)A級(jí)和滋養(yǎng)層細(xì)胞A、B級(jí)的胚胎。

本研究所有數(shù)據(jù)均來自同一中心，所有PGT-A均采用二代測(cè)序測(cè)方法檢測(cè)，盡可能減少了培養(yǎng)體系和技術(shù)相關(guān)的偏差。本研究的局限性在于未能結(jié)合時(shí)差成像系統(tǒng)精準(zhǔn)評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育速度，且由于樣本量的限制，未按不同的病因進(jìn)行分組分析；另外，由于采集信息時(shí)間的問題，部分患者尚未完成分娩，因此僅將臨床妊娠作為妊娠結(jié)局，分娩結(jié)局及新生兒結(jié)局有待后續(xù)進(jìn)一步分析。

綜上所述，PGT-A周期中，囊胚發(fā)育速度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)等級(jí)、滋養(yǎng)層細(xì)胞等級(jí)與整倍體狀態(tài)顯著相關(guān)，囊胚擴(kuò)張程度與整倍體狀態(tài)無關(guān)；對(duì)于早期妊娠結(jié)局，整倍體胚胎復(fù)蘇移植周期的臨床妊娠率與囊胚發(fā)育速度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)等級(jí)、滋養(yǎng)層細(xì)胞等級(jí)及囊胚擴(kuò)張程度均無相關(guān)性。