外泌體在結(jié)腸癌和成纖維細胞間交互影響中的作用研究進展

尹貽倩，陳藝文，趙雨雪，賈曉楠，韓月，鄒晨，茅凌翔，許化溪

(1. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江212002； 2. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 3. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院胃腸外科，江蘇 鎮(zhèn)江212002)

結(jié)腸癌是由于癌基因或者抑癌基因遺傳或表觀遺傳突變導致，發(fā)病率位居第3的消化道惡性腫瘤[1-2]，全球每年約有120萬新診斷病例，每年報告的死亡人數(shù)為70萬[3]。據(jù)預測，到2035年全球因結(jié)腸癌死亡的人數(shù)將增加60%[4]。結(jié)腸癌治療以手術治療和化療放療為主，但仍有40%的結(jié)腸癌患者死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。

19世紀80年代，研究者們提出“種子-土壤”假說來形容腫瘤與腫瘤微環(huán)境的關系。腫瘤微環(huán)境由間質(zhì)細胞和基質(zhì)液組成，其中成纖維細胞是腫瘤間質(zhì)中數(shù)量最豐富的細胞類型，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞也可以通過多種途徑，作用于微環(huán)境中的間質(zhì)細胞。外泌體是細胞分泌的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，其內(nèi)容物包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物活性分子，是結(jié)腸癌細胞和成纖維細胞間交互影響的重要媒介，本文就外泌體在結(jié)腸癌細胞和成纖維細胞間交互影響的作用及其機制作一綜述。

1 成纖維細胞

腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細胞主要包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、周皮細胞等，在實體惡性腫瘤中，成纖維細胞可被激活為腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblast，CAF)，其占據(jù)間質(zhì)細胞總數(shù)的50%。CAF形態(tài)為長梭形，其增殖能力、蛋白合成能力及細胞周期活性均明顯高于正常成纖維細胞。CAF具有高度異質(zhì)性，有多種不同表型和功能的亞型，通常根據(jù)不同的標志物來辨別，包括α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，纖維連接蛋白(fibroblast activating protein，F(xiàn)AP)，血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFRβ)，纖維特異性蛋白(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP1 或 S100A4)，小窩蛋白-1(caveolin-1，CAV-1)，CD29[5]和細胞表面蛋白CD10，G蛋白偶聯(lián)受體7和CD146[6]等。

CAF可通過多種方式影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CAF借助合成和降解成分來改變胞外基質(zhì)，并通過交聯(lián)酶、蛋白酶重塑其結(jié)構(gòu)，建立腫瘤的安全屏障； CAF還通過分泌可溶性介質(zhì)直接促進腫瘤細胞增殖和生存、促進血管生成。此外，CAF還能發(fā)揮負向免疫調(diào)節(jié)作用，助力腫瘤逃避免疫監(jiān)視。

2 外泌體

外泌體是一類直徑為30～150 nm的脂質(zhì)雙分子層囊泡，包裹多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其他代謝物，可以被大多數(shù)類型細胞分泌，并且廣泛存在于尿液、乳液、淚液、腦脊液等體液中[7]。外泌體的形成包括兩個步驟，一是早期核內(nèi)體膜內(nèi)陷形成腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，然后成熟為晚期核內(nèi)體即多泡體(multivesicular bodies，MVBs)；二是MVBs與質(zhì)膜融合后，將腔內(nèi)囊泡釋放到胞外，即外泌體。外泌體可以參與多種生理活動，包括細胞間通訊、哺乳動物繁殖和免疫調(diào)節(jié)等，并在心血管疾病、神經(jīng)變性和癌癥等疾病的病理進展中起重要作用。近年來，外泌體在腫瘤細胞與成纖維細胞之間的通訊作用成為研究熱點。

3 結(jié)腸癌來源的外泌體對成纖維細胞的影響

3.1 激活成纖維細胞

結(jié)腸癌源性外泌體對成纖維細胞的影響主要分為兩方面，一是激活成纖維細胞為CAF，二是使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，兩者均能有效地促進結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)腸癌來源的外泌體中miRNA-10b可直接靶向基質(zhì)中正常成纖維細胞中的磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位(PIK3CA)，降低PI3K/Akt/mTOR信號通路活性，促進成纖維細胞TGF-β 和α-SMA的表達，從而使其激活為CAF，利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。Rai 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將原發(fā)性結(jié)腸癌細胞SW480和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細胞SW620分泌的外泌體分別加入靜止的正常成纖維細胞上清液中，成纖維細胞的α-SMA表達顯著增強，基質(zhì)重塑能力增強，激活為CAF；其中，SW480來源的外泌體激活后的CAF具有高度促進腫瘤增殖和促血管生成的能力，SW620來源的外泌體激活后的CAF具有促腫瘤侵襲的能力。結(jié)腸炎可發(fā)展為結(jié)腸癌，利用右旋糖酐硫酸鈉誘導小鼠結(jié)腸炎后，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞分泌的胞外囊泡中表皮生長因子能夠激活成纖維細胞，從而利于結(jié)腸癌的發(fā)展[10]。抑癌基因p53缺失的結(jié)腸癌細胞HCT116來源的外泌體攜帶過量miRNA-4534，通過抑制成纖維細胞自噬相關蛋白2B(autophagy-related 2B，ATG2B)的表達，激活成纖維細胞，從而加速成纖維細胞介導的癌細胞增殖[11]。肌成纖維細胞是一種呈現(xiàn)為激活狀態(tài)的成纖維樣細胞，以α-SMA的表達為特征。在實體癌中，富含肌成纖維細胞的微環(huán)境可以支持腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細胞系Caco-2通過外泌體中TGF-β刺激正常成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，表明結(jié)腸癌來源的外泌體是激活成纖維細胞的重要參與者[12]。

3.2 促進成纖維細胞的增殖和遷移

2009年，研究者對人結(jié)腸癌細胞SW480進行了細胞轉(zhuǎn)錄組分析，并首次鑒定出11 327個參與腫瘤發(fā)生相關過程的mRNA，其中有241種mRNA富集于結(jié)腸癌細胞來源的外泌體中，27種參與了細胞周期相關的活動[13]，關于這些分子在成纖維細胞中發(fā)揮的作用需要后續(xù)實驗研究。ΔNp73mRNA(p73基因的異構(gòu)體)與致癌潛能相關，可以被包裹在結(jié)腸癌細胞分泌的外泌體中，促進其他結(jié)腸癌細胞以及基質(zhì)中的成纖維細胞、內(nèi)皮細胞的增殖。并且，外泌體ΔNp73mRNA存在于結(jié)腸癌患者的血清中，可作為預后判斷的標志物[14-15]。癌源性外泌體中miRNA被認為是細胞惡化的誘因，通過影響腫瘤微環(huán)境中的血管生成、基質(zhì)細胞增殖、遷移從而促進腫瘤的發(fā)生。結(jié)腸癌細胞分泌的外泌體攜帶一些miRNAs(miRNA-1249-5p，miRNA-6737-5p和miRNA-6819-5p)，抑制成纖維細胞中的抑癌基因p53的表達，從而促進腫瘤的發(fā)展[16]。結(jié)腸癌細胞HT-29和SW480來源外泌體中的miRNA-let-7d能夠下調(diào)CAF中趨化蛋白(CCL7)的表達，抑制其抗腫瘤免疫反應，從而促進結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲[17]。丁酸鈉誘導分化的人結(jié)腸癌細胞HT-29分泌大量的含CD133的外泌體，能夠促進人結(jié)腸癌細胞HCT116和大鼠正常成纖維細胞Rat-1的增殖和遷移[18]。

4 成纖維細胞來源的外泌體對結(jié)腸癌細胞的影響

4.1 提高結(jié)腸癌細胞的耐藥性

5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和氨甲蝶呤是治療結(jié)腸癌常用的化療藥物，但是大多數(shù)患者會出現(xiàn)固有和獲得性耐藥，其中位生存期只有20個月左右。因此，關于結(jié)腸癌耐藥性機制的問題亟待解決。Hu等[19]將結(jié)腸成纖維細胞系(CCD-18Co)和CAF分泌的外泌體分別加入體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞系SW620衍生和體內(nèi)分離的腫瘤干細胞中，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞來源的外泌體能夠增加腫瘤干細胞對5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的耐藥性。進一步的研究表明，CAF來源的外泌體能通過Wnt信號通路增加腫瘤干細胞的百分比，促進集落形成和腫瘤生長，從而提高腫瘤細胞的耐藥性。

miRNA是一類具有18～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，可被包裹在外泌體中參與細胞的增殖、分化、代謝和凋亡。CAF利用外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-92a-3p至結(jié)腸癌細胞，而高水平的miRNA-92a-3p通過直接抑制靶基因F框/WD40域蛋白7(F-Box and WD40 domain protein 7，F(xiàn)BXW7)和凋亡調(diào)節(jié)因子1(modulator of apoptosis 1，MOAP1)，激活Wnt/β-catenin通路，從而抑制線粒體凋亡，促進了結(jié)腸癌細胞的干性、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和對5-氟尿嘧啶的耐藥[20]。研究報道，CAF來源外泌體中的miRNA-24-3p可通過結(jié)腸癌細胞中尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2/膜鐵轉(zhuǎn)運輔助蛋白(CDX2/HEPH)軸，抑制細胞凋亡和促進腫瘤生長，并且增強結(jié)腸癌細胞對甲氨蝶呤的耐藥；而轉(zhuǎn)染miRNA-24-3p抑制子的CAF來源的外泌體能夠降低結(jié)腸癌細胞的活力和集落形成，增加細胞凋亡，抑制體內(nèi)腫瘤生長，這為提高氨甲蝶呤在臨床結(jié)腸癌治療中的敏感性提供一個潛在靶點[21]。近年來，放射治療被認為是減少局部復發(fā)的標準術前治療方法，可促進細胞凋亡。然而，結(jié)腸癌細胞對放療產(chǎn)生的耐藥性成為減少結(jié)腸癌細胞死亡的主要障礙。放療情況下，CAF分泌的外泌體中含有高水平的miRNA-93-5p，與結(jié)腸癌細胞SW480共孵育后，結(jié)腸癌細胞的增殖能力和克隆形成能力加強。它的可能調(diào)控機制為miRNA-93-5p在結(jié)腸癌細胞內(nèi)通過抑制叉頭框蛋白A1(FOXA1)的表達激活TGF-β信號通路，從而抑制結(jié)腸癌細胞的凋亡，增強其對放療的抵抗性[22]。相似地，CAF來源的外泌體中miRNA-590-3p能在結(jié)腸癌細胞中抑制其靶基因氯化物通道附件4(CLCA4)，從而激活CLCA4原本抑制的PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)DNA損傷應答反應，抑制細胞凋亡，增強結(jié)腸癌細胞SW620和HCT116對放療的抵抗力[23]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，通過與DNA、染色體、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)作用，調(diào)控細胞的生命活動。CAF通過釋放含有高水平lncRNA H19的外泌體，作用于miRNA-41激活結(jié)腸癌細胞的Wnt/β-catenin信號途徑，以提高其對奧沙利鉑的耐藥性和促進其干性[24]。結(jié)腸癌相關lncRNA(CCAL)可以通過外泌體從CAF轉(zhuǎn)移到結(jié)腸癌細胞，與mRNA結(jié)合蛋白HuR相互作用，激活β-catenin信號通路，提高結(jié)腸癌細胞對奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶的抵抗性[25]。

4.2 促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和進展

癌細胞轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段、多基因調(diào)控的過程，涉及癌細胞從原發(fā)部位逃逸、缺乏免疫監(jiān)視和腫瘤微環(huán)境的協(xié)同作用，是結(jié)腸癌患者死亡的主要原因。研究者們從結(jié)腸癌組織及癌旁組織分別分離出CAF和成纖維細胞，并對它們分泌的外泌體進行miRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)CAF來源的外泌體中miRNA-21豐度最高，且利用結(jié)腸原位癌模型證明miRNA-21可通過其外泌體傳遞給結(jié)腸癌細胞，促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[26]。Zhang等[27]研究表明CAF來源的外泌體將miRNA-17-5p傳遞給結(jié)腸癌細胞，調(diào)控RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子3 (RUNX3)信號軸以激活TGF-β1途徑，促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。隨后，大量的TGF-β1被分泌到胞外基質(zhì)中，反過來激活成纖維細胞，由此形成促進結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的正反饋。研究表明miRNA-135b-5p經(jīng)CAF源性外泌體傳遞到結(jié)腸癌細胞，通過下調(diào)細胞中硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)表達，促進結(jié)腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成[28]。

Linc00659是一種lncRNA，已被鑒定為一種新型癌基因，其在結(jié)腸癌中的表達水平顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)Linc00659經(jīng)CAF源性外泌體傳遞到結(jié)腸癌細胞Lovo和SW480中，通過抑制miRNA-342-3p上調(diào)膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)的表達，最終促進結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲、遷移和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化[29]。

此外，CAF來源的胞外囊泡能夠攜帶表皮生長因子家族成員雙調(diào)蛋白，促進結(jié)腸癌細胞增殖，但是其具體的作用機制未知[30]。

5 外泌體作為結(jié)腸癌診斷和預后的標志物

外泌體在結(jié)腸癌與成纖維細胞的交流中發(fā)揮信使功能，其運輸?shù)呢浳锱c其親本細胞有一定的相關性，可以作為判斷疾病進展的標志物。研究者們收集88例結(jié)腸癌患者和12例健康者的結(jié)腸組織樣本，對所有外泌體進行miRNA微陣列分析后發(fā)現(xiàn)，相比于健康者的結(jié)腸組織，7種miRNAs(let-7a、miRNA-1229、miRNA-1246、miRNA-150、miRNA-21、miRNA-223和miRNA-23a)在結(jié)腸癌患者組織來源的外泌體中表達量較高，或可作為結(jié)腸癌早期診斷的標志物[31]。Bahnassy等[32]比較了124例結(jié)腸癌Ⅱ期患者和100例健康者結(jié)腸組織中miRNA的表達量，發(fā)現(xiàn)miRNA-21、Let-7a-5p、miRNA-100-5p、miRNA-200c-3p和miRNA-23b-3p可作為Ⅱ期結(jié)直腸癌常用的診斷標志物，miRNA-21、miRNA-498和miRNA-320可以預測結(jié)腸癌的復發(fā)和患者的生存。這些miRNAs是否也存在于結(jié)腸癌組織來源的外泌體中，用于結(jié)腸癌的診斷標志物還需進一步探究。另有研究通過二代測序技術對CAF和成纖維細胞及其分泌的外泌體中的非編碼RNA進行了檢測和生物信息學分析，其中miRNA-6087 和miRNA-AL353644.1在CAF來源的外泌體中含量更高，并且可能作為結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的診斷標志物[33]。

Mathivanan等[34]利用免疫捕獲法分離結(jié)腸癌細胞系LIM1215來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)了多種具有組織特異性的蛋白，如A33、鈣黏蛋白-17(cadherin-17)、閉合蛋白1(claudin 1)等，可能作為結(jié)腸癌診斷的標志物。但是由于當時外泌體的分離、純化、鑒定方法不完善，獲得數(shù)據(jù)的準確性和實用性降低，需要進一步探究。結(jié)腸癌細胞來源外泌體中干擾素調(diào)節(jié)因子-2(interferon regulatory factor-2，IRF-2)被巨噬細胞吸收，促進淋巴管的生成，可用于預測結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移情況[35]。Ganig等[36]發(fā)現(xiàn)，靜息硫基氧化酶1(quiescin sulfhydryl oxidase 1，QSOX1)蛋白含量在結(jié)腸癌患者的血漿以及成纖維細胞分泌的外泌體中顯著下降，因而認為QSOX1是一種有前途的結(jié)腸癌早期診斷和無創(chuàng)風險分層的新標志物。除此之外，有研究報道二萜內(nèi)酯化合物(ovatodiolide)可以通過降低結(jié)腸癌細胞分泌的外泌體中β-catenin/STAT3/miRNA-1246的含量，抑制腫瘤干細胞的形成和惡性間質(zhì)-上皮的轉(zhuǎn)化，為治療癌癥提供了臨床前證據(jù)[37]。外泌體包裹的這些物質(zhì)可以作為預測結(jié)腸癌發(fā)展的標志物，但不是診斷的金標準，其特異性還需大量研究驗證。

6 結(jié)語

結(jié)腸癌和成纖維細胞釋放的外泌體在原發(fā)性腫瘤微環(huán)境中對調(diào)節(jié)癌癥進展起重要作用。成纖維細胞來源的外泌體參與驅(qū)動機制，促進腫瘤生長、遷移、轉(zhuǎn)移和耐藥性；結(jié)腸癌細胞來源的外泌體能更好地調(diào)控成纖維細胞，使之更好地輔助腫瘤細胞。結(jié)腸癌細胞以及成纖維細胞分泌的外泌體中包裹的miRNA、蛋白等可作為輔助診斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、耐藥、預后等的生物標志物，具有潛在的臨床應用價值。