劍麻可可毛色二孢葉斑病菌的鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)

關(guān)天博，崔曉東，陳愷宏，劉瓊光

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【研究意義】劍麻（Agave sisalanaPerr.ex Engelm.）也稱為菠蘿麻、龍舌蘭麻，屬于龍舌蘭科龍舌蘭屬的多年生硬質(zhì)纖維作物，主要分布在熱帶地區(qū)［1］，我國(guó)主要在廣東、廣西和海南等地種植［2］。劍麻纖維及其劍麻汁液提取物被廣泛應(yīng)用于國(guó)防、石油、交通運(yùn)輸、冶金、工礦、捕撈和農(nóng)林牧業(yè)、食品、制藥等領(lǐng)域，具有較大的綜合利用價(jià)值和較廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景［3-7］。在我國(guó)廣東、廣西兩大優(yōu)勢(shì)劍麻種植區(qū)，其產(chǎn)量和種植面積均占全國(guó)95%以上。近年來，在廣東湛江地區(qū)劍麻上嚴(yán)重發(fā)生一種葉斑病，其癥狀為：在劍麻葉片產(chǎn)生近圓形、橢圓形黑色病斑，病部凹陷，病健交界明顯，后期病斑可變?yōu)榛野咨?，?dǎo)致劍麻葉片大面積壞死，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。明確該葉斑病的病原菌種類以及測(cè)定該病原菌對(duì)化學(xué)藥劑的敏感性，對(duì)該劍麻葉斑病的有效防治具有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，我國(guó)劍麻主栽品種為H.11648，該品種特點(diǎn)是產(chǎn)量較高，但易感病［2］。由于劍麻生產(chǎn)種植規(guī)模較為集中，長(zhǎng)期栽種品種較為單一，導(dǎo)致病蟲害問題比較突出。劍麻主要病害有斑馬紋?。≒hytophthora nicotianae）、莖腐病（Aspergillus niger）、紫色尖端卷葉病、葉斑病（Dothiorella sisalanae.）、褐斑病（Diplodia natalensis）、炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）和潰瘍?。∟eoscytalidium dimidiatum）等［2,8-11］。其中，劍麻斑馬紋病在劍麻生產(chǎn)中是為害最為嚴(yán)重、發(fā)生規(guī)模最大的病害，其病原菌可侵害劍麻各個(gè)部位，嚴(yán)重者可導(dǎo)致劍麻植株死亡［8］。莖腐病是劍麻另一種常發(fā)病害，病原菌主要通過傷口侵入，使侵染部位腐爛發(fā)臭［9］。劍麻紫色尖端卷葉病最初于2001 年在海南省發(fā)現(xiàn)，近年來在各劍麻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。該病的發(fā)生可能與一種蠟蚧有關(guān)，導(dǎo)致劍麻植株頂部尖端葉片邊緣變紫，并向內(nèi)卷曲，同時(shí)產(chǎn)生大量褪綠黃斑，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株根部枯死甚至植株死亡。除上述3 種病害外，近年來劍麻葉斑病、炭疽病也逐漸上升為主要發(fā)生病害，它們嚴(yán)重為害植株葉片，導(dǎo)致劍麻葉片失去利用價(jià)值［2,9］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2019 年，在廣東省湛江市的劍麻種植基地中，發(fā)生一種劍麻葉斑病，該病害在劍麻種植區(qū)時(shí)有發(fā)生，對(duì)當(dāng)?shù)貏β楫a(chǎn)業(yè)構(gòu)成威脅，然而，迄今引起該劍麻葉斑病的病原尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對(duì)劍麻葉斑病病原進(jìn)行分離鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選，以期為該病的防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本采集

2019 年6－12 月，在湛江地區(qū)劍麻種植產(chǎn)區(qū)采集葉片近圓形、橢圓形或不規(guī)則形黑色斑點(diǎn)、病部?jī)?nèi)陷、邊緣無(wú)暈圈等明顯癥狀的劍麻病葉，裝入密封袋，對(duì)樣品進(jìn)行拍照記錄，帶回華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行病原菌的分離和純化。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)及純化

采用組織分離培養(yǎng)法，所用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA（Potato Dextrose Agar）對(duì)劍麻葉斑病菌進(jìn)行分離，步驟為：選取帶有明顯癥狀的劍麻葉片組織，用滅菌水沖洗，在病健交界處用無(wú)菌小刀切取大小4～5 mm的組織塊，用75%酒精表面消毒1 min，轉(zhuǎn)置于0.1%次氯酸鈉溶液中消毒3 min，無(wú)菌水清洗3～4 次，轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上。將消毒后的病組織均勻擺放到PDA平板上，每皿4～5 塊，放好后輕微按壓，防止病組織掉落，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。待病組織邊緣長(zhǎng)出菌絲后，用滅菌牙簽在菌落邊緣挑取一小塊培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到新的PDA 培養(yǎng)基上，多次重復(fù)純化，最終獲得純培養(yǎng)菌。

1.3 病原菌的致病性測(cè)定

將分離、純化得到的分離物在PDA 平板上30 ℃培養(yǎng)2～3 d，接種針劃取大小一致的小菌塊，備用。將種植于溫室盆栽中的健康劍麻葉片用70%酒精表面消毒，滅菌水沖洗1～2 次，用消毒針在葉片上輕微刺傷，用打孔器取培養(yǎng)2～3 d的分離物菌絲塊（帶有PDA 培養(yǎng)基）貼于葉片傷口處，每片葉接種2 處，以無(wú)菌PDA 培養(yǎng)基作為對(duì)照。所有接種處均用雙層紙巾輕微包裹，防止菌餅滑落，對(duì)接種好的劍麻葉片表面噴滅菌水保濕24 h，每個(gè)分離物接種3 片葉，將所有劍麻植株置于溫室中培養(yǎng)。約1 周后待劍麻葉片表面出現(xiàn)發(fā)病癥狀，觀察并記錄發(fā)病情況，并與所采集到的田間病害癥狀比較。若有發(fā)病，則從發(fā)病處取病健交界組織，對(duì)病原菌再次進(jìn)行分離純化，觀察是否獲得與分離相同的致病菌。

1.4 科赫氏法則驗(yàn)證

從接種劍麻發(fā)病癥狀與田間癥狀相似的部位，重新分離病原菌，參照1.2 方法，通過菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行顯微觀察，確定是否與接種的病原菌一致。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

選取科赫氏法則驗(yàn)證后確定為致病菌的菌株，進(jìn)行ITS 序列分析。采用DNA 提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕，按說明書提取病原菌DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物，ITS1（5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG -3’）和ITS4（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’）［12］。引物合成及PCR 產(chǎn)物序列測(cè)定由英駿生物技術(shù)有限公司完成。

PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，20 μmol/L 引物各0.5 μL，5 U/μL Taq 酶0.5 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取擴(kuò)增條帶清晰且長(zhǎng)度約為540 bp的目標(biāo)條帶，切膠回收，送英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果，在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。

1.6 病原菌藥劑毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定。供試殺菌劑為98.5%百菌清原粉、97%甲基硫菌靈原粉、97% 咪鮮胺原粉、95% 己唑醇原粉、97%戊唑醇原粉、96.5%苯醚甲環(huán)唑原粉、90.65% 氟吡菌酰胺原粉、93% 醚菌酯原粉，以上藥劑由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細(xì)菌和殺菌劑研究室提供。稱取原藥各0.1 g，用10 mL 無(wú)水乙醇溶解，配置成母液。在預(yù)實(shí)驗(yàn)及查閱相關(guān)資料［13-16］的基礎(chǔ)上，將8 種藥劑原藥各設(shè)置成5 個(gè)對(duì)應(yīng)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度3 個(gè)重復(fù)。按照各待測(cè)藥劑的不同濃度，分別加入PDA 培養(yǎng)基中，配置好不同藥劑的含毒介質(zhì)PDA平板。各濃度藥劑取1 mL 分別加入49 mL 融化并稍冷卻的PDA 培養(yǎng)基中，充分混勻，以等量無(wú)水乙醇的PDA 為對(duì)照。待培養(yǎng)基冷卻晾干后，用直徑5 mm的打孔器在培養(yǎng)3 d的待測(cè)菌PDA 平板上，獲得均勻一致的菌餅，將菌餅轉(zhuǎn)接到含有不同藥劑的PDA 培養(yǎng)基中央，以接種無(wú)水乙醇的PDA 平板為對(duì)照。30℃恒溫培養(yǎng)箱3～5 d，待對(duì)照平板菌落直徑約85 mm 時(shí)，用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑，計(jì)算該濃度藥劑對(duì)病菌的抑制率：

抑制率（%）=〔1-（處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）〕×100

依次求得毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

2.1.1 癥狀觀察 觀察田間發(fā)病劍麻植株，發(fā)現(xiàn)病斑主要集中在劍麻葉片前半段，且發(fā)病處病斑較為密集（圖1A）。葉片上病斑近圓形、橢圓形或者不規(guī)則，黑色凹陷，病健交界明顯，外圍無(wú)黃暈，后期葉肉組織發(fā)白壞死，部分病斑聯(lián)結(jié)成較大的條狀病斑，葉片邊緣發(fā)病，呈不規(guī)則形大斑，向葉片中部?jī)?nèi)陷，后期變?yōu)榛野咨▓D1B、C），初步判斷該病害為真菌性病害。

圖1 劍麻葉斑病的發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of sisal leaf spot disease

2.1.2 病原菌的分離及純化 選取典型癥狀劍麻病組織，用PDA 培養(yǎng)基分離，經(jīng)多次純化共獲得11 個(gè)真菌分離物，進(jìn)一步用科赫氏法則對(duì)這11個(gè)疑似病原真菌進(jìn)行驗(yàn)證。

2.1.3 病原菌的致病性測(cè)定 將分離獲得的11 個(gè)真菌分離物在室內(nèi)進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2 種真菌出現(xiàn)與田間癥狀相似的癥狀（圖2），其余9 個(gè)分離物接種均不發(fā)病。接種編號(hào)為JMLT06的真菌，其劍麻葉片出現(xiàn)明顯的真菌性葉斑病癥狀，病斑黑色，病部?jī)?nèi)陷，病健交界明顯，組織壞死（圖2A）。接種JMLT08的劍麻葉片出現(xiàn)與JMLT06相同的癥狀，但病部中央顏色變?yōu)榛野咨?，葉片組織壞死更為嚴(yán)重（圖2B）。接種對(duì)照劍麻葉片，未見任何發(fā)病癥狀，只有戳刺后留下的針孔（圖2C）。接種JMLT06 和JMLT08 兩個(gè)菌株后劍麻的發(fā)病癥狀與田間癥狀（圖2D）相似，表明JMLT06 和JMLT08 兩個(gè)真菌為致病菌。

圖2 分離的劍麻葉斑病菌接種劍麻葉片癥狀Fig.2 Symptoms of sisal leaves inoculated with isolates of sisal leaf spot disease

2.1.4 科赫氏法則驗(yàn)證和病原菌的形態(tài)觀察 從接種后發(fā)病的劍麻葉片組織中再次進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得的純培養(yǎng)菌其菌落形態(tài)特征非常相似，生長(zhǎng)迅速，2～3 d 即可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿（D=85 mm）。在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，放射狀，邊緣不整齊；菌絲生長(zhǎng)初期為白色，產(chǎn)生豐富的氣生菌絲，似絨毛狀，隨著生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)榛液谏?，在顯微鏡下觀察出現(xiàn)分隔、分支的情況，菌落背面為藍(lán)灰色或近黑色（圖3）。

圖3 劍麻葉斑病菌在PDA 平板上的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology on PDA plate of pathogen causing sisal leaf spot disease

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其分生孢子橢圓形，單孢，深褐色，中間有一條中橫隔隔開，形似雙胞結(jié)合在一起（圖4）。根據(jù)分生孢子的形態(tài)特征，初步鑒定為毛色二孢屬（Lasiodiplodia）。

圖4 葉斑病菌JMLT08的分生孢子形態(tài)Fig.4 Conidial morphology of JMLT08 leaf spot disease

2.1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 利用ITS 通用引 物ITS1（5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG -3’）和ITS4（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’）分別對(duì)JMLT06 和JMLT08 菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到547 bp 和544 bp 目的片段，純化目的片段后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)致病菌的序列在GenBank 中與可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）（GenBank:MN831966.1）的同源性達(dá)到99%以上，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JMLT06 和JMLT08 均與Lasiodiplodia theobromae聚為一類（圖5）。結(jié)合其形態(tài)特征，可將JMLT06 和JMLT08 初步鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。

圖5 JMLT06 和JMLT08 菌株ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of ITS sequences of JMLT06 and JMLT08 strains

2.2 殺菌劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定

選擇JMLT08 菌株，對(duì)其進(jìn)行室內(nèi)平板藥劑篩選試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在供試的8 種殺菌劑中，EC50值存在明顯差異。EC50值反映殺菌劑對(duì)病原菌的抑制作用，EC50值越小，表明藥劑對(duì)病菌毒力越強(qiáng)。本研究結(jié)果（表1）表明，98.5%百菌清的殺菌毒力最強(qiáng)，EC50值為0.000132 μg/mL。其次為95%己唑醇、97%咪鮮胺、97%戊唑醇、96.5%苯醚甲環(huán)唑等4 種藥劑，均具有較好的殺菌活性，4 種藥劑的EC50值均低于1 μg/mL，分別為0.0246、0.0603、0.0623、0.10 μg/mL。90.65%氟吡菌酰胺和97%甲基硫菌靈對(duì)JMLT08毒力稍低，EC50值分別為1.28、1.83 μg/mL。在這8 種藥劑中，毒力最差的為93%醚菌酯，EC50值為60.00 μg/mL。

表1 8 種藥劑對(duì)JMLT080 菌株的毒力測(cè)定結(jié)果Table 1 Toxicity test results of 8 fungicides to JMLT08 strain

依據(jù)EC50值小于2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)，表明百菌清、己唑醇、咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌靈等7 種藥劑對(duì)可可毛色二孢菌均具有較好的殺菌效果，其中效果最好的為百菌清。

3 討論

以往研究表明，我國(guó)劍麻上共發(fā)生有炭疽病、莖腐病、紫色尖端卷葉病、條紋病、斑馬紋病、黑斑病、褐斑病、葉斑病、梢腐病和根結(jié)線蟲病等10 種劍麻病害［2,8-11］，其中5 種劍麻真菌病害，其病原菌分別為黑曲霉（Aspergillus niger）引起的劍麻莖腐病、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的劍麻炭疽病、蒂腐色二孢（Diplodia natalensis）引起的劍麻黑斑病、新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidium dimidiatum)引起的劍麻潰瘍病和交鏈格孢(Alternaria alternata)引起的劍麻葉斑病，莖腐病、葉斑病和炭疽病對(duì)劍麻的品質(zhì)和產(chǎn)量影響最大［2,9］。本研究鑒定了劍麻上的一種葉斑病病原菌，通過對(duì)病原菌的分離、純化和致病性測(cè)定，以及對(duì)病原菌的形態(tài)觀察和ITS序列分析，將該劍麻葉斑病病原菌初步鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae），由可可毛色二孢菌引起的劍麻葉斑病目前在國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。

可可毛色二孢菌是一種在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布的土傳病原真菌，其寄主范圍廣泛，可侵染500 多種植物，引起葉斑、潰瘍、梢枯、枝枯、根腐、果腐、流膠、壞死等癥狀［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，劍麻也是可可毛色二孢菌的寄主之一。據(jù)報(bào)道，可可毛色二孢菌在海南為害菠蘿［19］，在廣西可為害芒果［13］，此外，茶樹、桉樹、橡膠樹、朱槿等作物上也發(fā)現(xiàn)該真菌侵染［15,16,20,21］。可可毛色二孢菌侵染茶樹后，可在葉片上產(chǎn)生褐色或黑色點(diǎn)狀病斑，隨后逐漸擴(kuò)大為不規(guī)則病斑，最后導(dǎo)致葉片壞死［20］；侵染橡膠樹可引起葉斑病，且橡膠樹葉片邊緣向上卷曲［16］；而侵染桉樹和朱瑾?jiǎng)t分別產(chǎn)生枝枯和莖腐癥狀，嚴(yán)重可致植株死亡［15,21］。據(jù)報(bào)道，可可毛色二孢菌還可引起春芋葉斑病［22］、獼猴桃葉斑病［23］和樟樹潰瘍?。?4］等，由此可見，可可毛色二孢菌的寄主范圍非常廣，且癥狀類型不一，但本研究中侵染劍麻的可可毛色二孢菌是否侵染其他植物，有待于進(jìn)一步研究。

為有效防治可可毛色二孢菌引起的劍麻葉斑病，進(jìn)行了室內(nèi)藥劑毒力篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，百菌清、己唑醇、咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌靈等7 種藥劑對(duì)可可毛色二孢菌均具有顯著的抑菌效果。相關(guān)研究表明，咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈等藥劑對(duì)可可毛色二孢菌引起的桉樹、芒果、大葉傘和橡膠樹病害有較好的防治效果［13,15-16,25］，其中25%咪鮮胺對(duì)引起桉樹枝枯病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.03 mg/L［15］，戊唑醇懸浮劑對(duì)引起芒果流膠病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.1662 μg/mL［13］，10% 苯醚甲環(huán)唑水分散性粒劑對(duì)引起大葉傘干腐病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.10 μg/mL［25］，70% 甲基硫菌靈對(duì)引起橡樹葉斑病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.2019 μg/mL［16］。本研究結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)β榭煽擅呔腅C50值與前人研究結(jié)果相符，戊唑醇的EC50值明顯低于前人研究，而咪鮮胺和甲基硫菌靈的EC50值明顯高于前人研究結(jié)果，其原因可能是：（1）侵染劍麻的可可毛色二孢菌與侵染其他植物的可可毛色二孢菌對(duì)同一藥劑的敏感性不同；（2）藥劑的劑型和含量不同，本研究所用的藥劑均為原藥粉劑，均比前人所用的藥劑含量高。此外，百菌清、氟吡菌酰胺和己唑醇對(duì)可可毛色二孢菌的毒力作用以往未見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)百菌清對(duì)劍麻可可毛色二孢菌的毒力最強(qiáng)，其EC50值為0.000132 μg/mL，進(jìn)一步豐富了前人研究結(jié)果，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)上劍麻可可毛色二孢葉斑病的化學(xué)防治。

4 結(jié)論

廣東湛江地區(qū)發(fā)生的一種劍麻葉斑病，初步鑒定是由可可毛色二孢真菌（Lasiodiplodia theobromae）引起，病菌侵入劍麻葉片，產(chǎn)生大量近圓形、橢圓形黑色病斑，病部凹陷，病健交界明顯，導(dǎo)致劍麻葉片大面積壞死，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，生產(chǎn)上需要警惕該葉斑病的防治。該病原菌對(duì)百菌清、己唑醇、咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌靈等藥劑敏感，這些藥劑可用于劍麻可可毛色二孢葉斑病的化學(xué)防治。