病原微生物檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展

唐尹勤

關(guān)鍵詞：病原微生物;檢驗(yàn)技術(shù);綜述

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q93 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2022）08--01

一切可以導(dǎo)致疾病發(fā)生的病原體都稱(chēng)為病原微生物，其在宿主中進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖、釋放毒性物質(zhì)等，可引起機(jī)體不同程度的病理變化，引起感染甚至傳染病。微生物感染性疾病在臨床治療中，均需進(jìn)行微生物檢驗(yàn)，以明確病原微生物類(lèi)型，再通過(guò)病原微生物耐藥性檢測(cè)，以便及時(shí)指導(dǎo)抗感染治療[1]。因此微生物檢驗(yàn)技術(shù)已成為臨床治療中比較重要的工作。傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)法（細(xì)菌分離、培養(yǎng)及生化反應(yīng)）速度比較慢，投入的人力物力比較大，難以適應(yīng)診斷與治療，不能滿足臨床診斷及流行病學(xué)研究[2]。隨著免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)及計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物檢驗(yàn)新技術(shù)已被推廣，提高其診斷水平。本文就病原微生物檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)

傳統(tǒng)微生物檢測(cè)需要細(xì)菌培養(yǎng)才能獲得結(jié)果，具有耗時(shí)、費(fèi)力、操作難度高的特點(diǎn)，且對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求較為嚴(yán)格，稍有失誤，就會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該種方法因細(xì)菌培養(yǎng)及繁殖時(shí)間較長(zhǎng)，拉長(zhǎng)了檢測(cè)周期，致使疾病的治療和防控工作無(wú)法滿足[3]。而微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)法的不足，可以提升臨床診斷的可靠性、時(shí)效性。

1.1顯色培養(yǎng)基技術(shù)

微生物在自身新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶能夠與顯色底物發(fā)生反應(yīng)，繼而顯示顏色，根據(jù)這一原理，出現(xiàn)了顯色培養(yǎng)基這一微生物快速檢驗(yàn)，以完成微生物的篩選分離，主要用于金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群等微生物[4-5]。顯色培養(yǎng)基可使得目標(biāo)微生物顯色明顯，有助于檢測(cè)人員根據(jù)顯色結(jié)果快速分析和判斷。根據(jù)顯色培養(yǎng)基的原理，經(jīng)過(guò)改進(jìn)，最終成為快速檢測(cè)紙片法[6]。

1.2基因探診技術(shù)

基因探診技術(shù)又稱(chēng)分子雜交技術(shù)，通過(guò)標(biāo)記特定DNA片段，使得待測(cè)單鏈核酸分子與DNA分子形成雙鏈核酸分子，快速識(shí)別目標(biāo)微生物。在基因探診技術(shù)的基礎(chǔ)上，形成基因芯片技術(shù)，預(yù)設(shè)DNA排列方式（微量點(diǎn)樣手段），在樣本分析、基因探針雜交方式，獲得微生物靶基因、含量等信息，進(jìn)而快速、準(zhǔn)確的確定病原微生物[7]。

1.3聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)剑╬olymerase chain reaction，PCR）是特定條件，特定DNA片段，快速擴(kuò)增處理（體外酶促反應(yīng)），監(jiān)測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)[8]。此外在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，產(chǎn)生定時(shí)定量PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)、PCR變形梯度凝膠電泳技術(shù)、PCR高分辨溶解曲線分析技術(shù)等。

1.4微生物自動(dòng)化鑒定技術(shù)

微生物自動(dòng)化鑒定技術(shù)是一項(xiàng)具有自動(dòng)化特征的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定技術(shù)，主要包括全自動(dòng)微生物鑒定專(zhuān)家系統(tǒng)、全自動(dòng)血液細(xì)菌培養(yǎng)儀。全自動(dòng)微生物鑒定專(zhuān)家系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)全自動(dòng)化檢測(cè)，不僅能夠保證檢測(cè)準(zhǔn)確性，還能夠提升檢測(cè)速度[9]。全自動(dòng)血液細(xì)菌培養(yǎng)儀基本上實(shí)現(xiàn)了全過(guò)程自動(dòng)化檢測(cè)，在標(biāo)本收入培養(yǎng)瓶后，放入儀器，配合熒光檢測(cè)器，如此就可自動(dòng)完成培養(yǎng)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)。

1.5免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括免疫酶技術(shù)、熒光免疫技術(shù)。免疫酶技術(shù)中運(yùn)用最為廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enayme liked immunosorbent assay，ELISA），其主要是通過(guò)酶的催化作用轉(zhuǎn)化物質(zhì)，將酶定位標(biāo)記物，觀察酶催化底物的顏色反應(yīng)，得到抗原抗體反應(yīng)。熒光免疫技術(shù)是利用免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記（熒光素視為標(biāo)記物），熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，確定抗原/抗體的基本情況[10]。

2 單細(xì)胞拉曼技術(shù)

單細(xì)胞拉曼技術(shù)可用于揭示物質(zhì)本質(zhì)，基于拉曼光譜分析原理，實(shí)現(xiàn)非培養(yǎng)、無(wú)標(biāo)簽、快速、高效、低成本的新方法。單細(xì)胞拉曼技術(shù)應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)中，其原理是在已建立的微生物拉曼圖譜庫(kù)基礎(chǔ)上，結(jié)合拉曼分析軟件和不同分析方法對(duì)病原微生物進(jìn)行鑒定;檢測(cè)內(nèi)容包括：培養(yǎng)后鑒定細(xì)菌、真菌、分枝桿菌，直接鑒定原始樣本（透析液、尿液、血液;“指紋圖譜”行原位檢測(cè)病原微生物種類(lèi)），生物膜檢測(cè)葡萄球菌，高度同源分枝桿菌鑒定（“指紋圖譜”差異峰區(qū)分）;優(yōu)勢(shì)是快速、非培養(yǎng)、無(wú)破壞性實(shí)現(xiàn)原位標(biāo)本檢測(cè)和難鑒定菌株準(zhǔn)確區(qū)分;不足是需要建立數(shù)據(jù)庫(kù)和專(zhuān)業(yè)分析軟件[11]。

近年來(lái)，單細(xì)胞拉曼技術(shù)朝著自動(dòng)化、智能化、高通量方向發(fā)展，結(jié)合自動(dòng)收集目標(biāo)細(xì)胞裝置，形成單細(xì)胞拉曼分選技術(shù)平臺(tái)，應(yīng)用于病原微生物自動(dòng)化檢測(cè)中，其原理是將預(yù)處理樣本實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞流動(dòng)至SRCS區(qū)（經(jīng)微流控芯片），行快速拉曼光譜檢測(cè)，分選出目標(biāo)細(xì)胞（信息系統(tǒng)控制下的細(xì)胞分選系統(tǒng)），進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè);具有篩選自動(dòng)、高效、準(zhǔn)確的活性細(xì)胞優(yōu)勢(shì)，但需特定的儀器和分析系統(tǒng)，且價(jià)格昂貴，檢測(cè)內(nèi)容主要包括：篩選高通量自動(dòng)化目標(biāo)微生物、檢測(cè)“腸道微生態(tài)”[12]。

目前大量廣譜數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)模型的建立仍需依賴(lài)專(zhuān)業(yè)的生物信息團(tuán)隊(duì)，近年來(lái)，涌現(xiàn)出了廣譜分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)示著智能化、便捷分析方法時(shí)代的來(lái)臨，但單細(xì)胞拉曼技術(shù)各項(xiàng)操作的標(biāo)準(zhǔn)有待建立，標(biāo)本前期處理、參數(shù)設(shè)置的差異限制了該技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。

3 基于納米技術(shù)的病原微生物核酸快速檢測(cè)

核酸是病原微生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，檢測(cè)核酸可快速診斷感染病原微生物類(lèi)型。納米材料具有特殊的光、電、熱、磁等，結(jié)合核酸檢測(cè)技術(shù)，可提高檢測(cè)速度。

3.1基于納米孔的單分子測(cè)序技術(shù)

納米孔由生物或聚合物材料制成，納米尺寸效應(yīng)在測(cè)序（核酸檢測(cè)）中發(fā)揮重要作用。納米孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)測(cè)序的方法是：核酸分子通過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生的電信號(hào)變化，是一種新型的無(wú)標(biāo)記、無(wú)擴(kuò)增技術(shù)，具有通量高、速度快、成本低、檢測(cè)序列長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Joshua Quick[13]等使用納米孔對(duì)埃博拉病毒行DNA檢測(cè)，1小時(shí)即可完成序列測(cè)定，可在有限條件下實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病毒，還可用于沙門(mén)菌、溶血性巴氏桿菌的檢測(cè)。生物納米孔的穩(wěn)定性、持久性較差，限制了納米孔的發(fā)展，而固態(tài)納米孔（納米材料：氮化硅、石墨烯）在穩(wěn)定性具有明顯優(yōu)勢(shì)，降低背景信號(hào)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

3.2基于納米材料的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

3.2.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用聚合酶在等溫條件下擴(kuò)增靶序列，放大信號(hào)，但存在結(jié)果判讀難的問(wèn)題。為了解決上述問(wèn)題，Orapan Manajit等[14]將金納米顆粒（AuNPs）與LAMP結(jié)合，實(shí)現(xiàn)銅綠假單胞菌的高效檢測(cè)。AuNPs與靶DNA互補(bǔ)雜交，抑制AuNPs因靜電作用而在鹽溶液中發(fā)生聚集現(xiàn)象，提高DNA-AuNPs的穩(wěn)定性，使溶液仍呈紅色（聚集時(shí)由紅色變?yōu)樗{(lán)色或透明），便于結(jié)果判讀?；贚AMP技術(shù)，出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP），用于布尼亞病毒、流感病毒等RNA檢測(cè)，但受實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備的限制，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、多重復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)。通過(guò)直接觀察待測(cè)液呈紅色，則判為陽(yáng)性反應(yīng)，使得RT-LAMP無(wú)需使用凝膠電泳或?qū)嵤岫葍x，即可判讀結(jié)果，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3.2.2 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)

鏈置換擴(kuò)增技術(shù)（strand displacement amplification，SDA）是一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，基于酶促反應(yīng)，主要利用限制性?xún)?nèi)切酶切割識(shí)別位點(diǎn)的核酸，聚合酶在切口處向下延伸，置換下游序列能力，擴(kuò)增核酸序列（等溫條件），進(jìn)行核酸檢測(cè)，但也需要特殊儀器。為了解決這一難題，Hongxing Liu等[15]將AuNPs與硫醇化后的RNA耦聯(lián)形成探診，實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，改良后的SDA技術(shù)，可檢測(cè)李斯特菌RNA，提高了傳統(tǒng)SDA的靈敏度和特異性。

3.2.3重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)，由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、鏈置換Bsu聚合酶參與，其可在較短時(shí)間和較低溫度條件下將核酸分子擴(kuò)增到可檢測(cè)水平。RPA技術(shù)的產(chǎn)物主要運(yùn)用側(cè)向流動(dòng)技術(shù)（LF）讀取，因其標(biāo)記物AuNPs具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，標(biāo)記目標(biāo)容易可視化，可直接肉眼觀察，廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)中。但實(shí)際應(yīng)用中，納米材料存在易于團(tuán)聚、批間差異性大、生物安全性有待提高等問(wèn)題，限制了其在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用，因此未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)納米材料在等溫技術(shù)中的應(yīng)用，進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)。

4 總結(jié)

近年來(lái)，病原微生物造成的感染性疾病發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅人們的身體健康，因此對(duì)病原微生物進(jìn)行早期檢測(cè)，是感染性疾病的防控關(guān)鍵。傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)主要包括細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定等，但所需時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)操作人員要求高，已出現(xiàn)“窗口期”而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。而微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)、單細(xì)胞拉曼技術(shù)、基于納米技術(shù)的病原微生物核酸快速檢測(cè)均可快速、準(zhǔn)確的判定病原微生物類(lèi)型，從而為感染性疾病的早期診斷和及時(shí)治療提供技術(shù)支撐。

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