景芝濃香大曲隨儲存期延長的變化規(guī)律

劉　雪 ，曹建全 ，李　霞 ，楊愛華 ，張學梅

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東景芝 262119； 2.山東省釀造食品生物發(fā)酵技術重點實驗室，山東景芝 262119）

大曲是我國古老的曲種，根據(jù)大曲在發(fā)酵中的作用也可將其稱為糖化發(fā)酵劑[1]，它巧妙地將野生菌進行人工自然培養(yǎng)，選育有益菌種，積蓄酶及發(fā)酵前體物質(zhì)，并為發(fā)酵提供營養(yǎng)物質(zhì)。

利用大曲生產(chǎn)的白酒稱為大曲酒，一般來說大曲酒比小曲酒、麩曲酒質(zhì)量好。俗話說“曲乃酒之骨[2]”，這充分說明了曲在白酒中的重要作用。大曲的主要原料是小麥，把小麥制成大曲的過程是一個培菌的過程，整個制曲工藝過程中有眾多種類的微生物先后交替、共同作用，關系極為復雜。簡單來說，大曲中的有益微生物將小麥等原料中的蛋白質(zhì)轉化為氨基酸、酚類化合物等香味成分，使其產(chǎn)生曲

香氣味，成為大曲酒微量香味成分的主要來源[3]。大曲除了是重要的糖化發(fā)酵劑和生香劑以外，還能夠富集各種微生物，整個制曲過程和儲存過程都是在開放性環(huán)境中進行的，大曲制作發(fā)酵完成后必須經(jīng)過適當?shù)膬Υ娌拍芡度肷a(chǎn)使用，適當?shù)膬Υ鎸τ诖笄馁|(zhì)量提升有著極其重要的作用。因此，本研究對不同儲存時間的中溫大曲和高溫大曲進行分析，主要從大曲理化指標變化和微生物的種類演變、數(shù)量變化規(guī)律方面進行研究，為合理設定大曲儲存時間提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料、儀器

樣品：景芝新出房中溫曲、新出房高溫曲、外購高溫曲（儲存3個月以上），裝袋后儲存，每隔1個月分析1次。

培養(yǎng)基：細菌及芽孢桿菌培養(yǎng)基：PCA培養(yǎng)基；霉菌和酵母培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術有限公司。

儀器設備：MLS-3751-PC高壓蒸汽滅菌鍋，日本松下公司；DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；厭氧培養(yǎng)盒，日本三菱公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；JY10002電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱，太倉實驗儀器廠。

1.2　實驗流程（圖1）

圖1　實驗流程圖

1.3　實驗方法

（1）大曲理化指標分析采用釀酒大曲通用分析方法QB/T 4257—2011。

（2）細菌總數(shù)計數(shù)采用GB 47892—2010食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定法；其中芽孢桿菌計數(shù)采用80℃加熱15 min后涂平板，培養(yǎng)24 h后計數(shù)；霉菌和酵母檢測采用GB4789.15—2010食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)法；乳酸菌檢測采用GB 4789.35—2010食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗法。

2　結果與分析

2.1　理化指標隨儲存期的變化

2.1.1　大曲水分、酸度的變化情況（表1）

表1中的分析數(shù)據(jù)顯示，在大曲儲存的5個月期間，水分和酸度兩項理化指標未隨儲存期的延長而發(fā)生變化。不同的大曲之間，水分差別不大，但高溫曲的酸度比中溫曲高。眾所周知，水分受環(huán)境的影響較大，由于樣品的儲存環(huán)境相對穩(wěn)定，因此水分未出現(xiàn)明顯變化規(guī)律。據(jù)報道，大曲中的酸有兩大來源，最主要的是由醋酸菌和乳酸菌代謝產(chǎn)生的醋酸和乳酸，其次就是原料中的脂肪、淀粉和蛋白酶發(fā)生降解而產(chǎn)酸[4]。據(jù)此分析酸度變化不大的原因主要是在制曲過程中微生物繁殖，引起了酸度的增加，制曲結束后，雖然生酸菌減少，但由微生物代謝產(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等開始水解淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)酸，因此使得大曲的酸度維持在一個相對穩(wěn)定的水平。

2.1.2　糖化力的變化情況（圖2）

圖2　大曲在不同儲存時間糖化力的變化情況

糖化力高可以提高出酒率，但不利于酒的質(zhì)量提高，而糖化力太低又不利于發(fā)酵，因此合適的糖化力水平對于白酒生產(chǎn)十分重要。由圖2可知，隨著儲存期的延長，大曲的糖化力均呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢。主要是由于進入儲存期后溫度降低，霉菌等產(chǎn)糖化酶的微生物開始繁殖，糖化力會

表1　中高溫大曲的水分和酸度隨儲存期延長的變化情況

出現(xiàn)一個短暫的上升期，隨著儲存時間的繼續(xù)延長（3個月后），糖化力便開始下降直到穩(wěn)定，這一點在霉菌的變化規(guī)律中也可以證實（圖7）。另外還可以看出，中溫大曲的糖化力較高，平均在1015葡萄糖mg/g·h左右，而高溫大曲的糖化力普遍低于中溫曲，平均約820葡萄糖mg/g·h，外購高溫曲1和景芝高溫曲糖化力基本接近，外購高溫曲2糖化力較低，處于300～500葡萄糖mg/g·h之間，是高溫曲較為理想的水平。中溫曲儲存至5個月時糖化力為960葡萄糖mg/g·h，仍然較高，因此實際應用時還要進一步延長儲存期或調(diào)整制曲工藝，將大曲的糖化力降到合適的水平。

2.1.3　液化力的變化情況（圖3）

圖3　大曲在不同儲存時間液化力的變化情況

糧食中的淀粉首先是轉變成糊精，然后再進一步轉化成糖，這一過程我們稱作液化，而液化力指的是微生物酶將淀粉轉化成糖的能力。由圖3可知，大曲儲存0～2個月時，液化力處于下降的趨勢，而3個月之后液化力開始逐步升高。這說明大曲在儲存過程中微生物酶的含量和活性也在發(fā)生變化，儲存3個月以上的大曲中微生物酶活力較高，因此液化力會有所提高。另外還可以看出高溫曲的液化力明顯低于中溫曲。

2.1.4　發(fā)酵力的變化情況（圖4）

圖4　大曲在不同儲存期發(fā)酵力變化情況

大曲的發(fā)酵力是反映大曲產(chǎn)酒能力的重要指標之一。發(fā)酵力與大曲中的酵母菌有關，它可以將酒醅中的糖分轉化為乙醇[5]。由圖4可知，大曲儲存前期，發(fā)酵力迅速下降，而3個月后發(fā)酵力趨于穩(wěn)定。因此一般大曲儲存滿3個月使用時，發(fā)酵力已經(jīng)處于較為理想的平穩(wěn)狀態(tài)。

圖5　細菌總數(shù)隨儲存時間的變化情況

2.2　儲存過程中微生物的消長情況（圖5—圖9）

大曲中的細菌主要包含芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等[6]，種類多，分布廣，生長快，是大曲產(chǎn)酸、分解蛋白質(zhì)的重要來源[7]，在大曲儲存過程中，細菌的變化趨勢如圖5所示，由圖5可知，大曲出房時細菌總數(shù)達到最高值，其中中溫曲為1.45×107cfu/g、高溫曲為3.7×105cfu/g，外購高溫曲1為1.6×105cfu/g，外購高溫曲2為2.8×104cfu/g，進入儲存期后,由于儲存環(huán)境干燥，不利于細菌的富集，菌數(shù)便逐漸下降。儲存至5個月時，中溫曲中細菌總數(shù)下降至2.23×106cfu/g，降低了84.6%，高溫曲由于制曲溫度較高，出房時細菌中的芽孢桿菌居多，能適應極端環(huán)境而不易死亡，因此儲存時下降幅度比中溫曲要小一點，儲存至5個月時細菌總數(shù)下降了20.8%，為2.93×105cfu/g。外購高溫曲1和高溫曲2也都有所下降。

圖6　芽孢桿菌總數(shù)隨儲存時間的變化情況

圖7　霉菌數(shù)量隨儲存時間的變化情況

芽孢桿菌在白酒釀造中具有非常重要的作用，能夠產(chǎn)生吡嗪類、揮發(fā)性酸、芳香類以及酚類物質(zhì)[8-9]，還能強化美拉德反應[10]，是影響白酒口感的重要菌株。據(jù)報道[11]，隨著儲存期的延長，細菌的種類趨于單一，芽孢桿菌成為優(yōu)勢菌種。由圖6可知，芽孢桿菌數(shù)量隨著儲存期的延長而明顯升高，在出房時中溫大曲芽孢桿菌的數(shù)量為8.97×104cfu/g，儲存3個月后開始明顯增多，儲存5個月時芽孢桿菌數(shù)增加到6.82×105cfu/g；高溫大曲芽孢桿菌數(shù)由剛出房的5.6×103cfu/g，增長到2.87×104cfu/g，提高了約4倍。結合細菌總數(shù)的變化趨勢（圖5）可以看出，細菌中芽孢桿菌所占的比例明顯上升，這說明雖然中溫曲儲存過程中細菌總數(shù)在降低，但芽孢桿菌數(shù)量并未下降，其減少的大部分都是雜菌，因此可以說大曲儲存的過程也是優(yōu)勢菌群自然篩選富集的過程。

圖8　酵母菌隨著儲存時間的變化情況

圖9　乳酸菌隨著儲存時間的變化情況

霉菌是大曲中主要的微生物，含有多種產(chǎn)糖化酶的菌種，與大曲的糖化力和液化力息息相關[12]。由圖7可知，外購高溫曲1霉菌的數(shù)量在3個月之后還持續(xù)上升，除此之外，其他大曲霉菌的數(shù)量整體都隨著儲存時間的延長而下降，分析原因可能是由于制曲過程中的溫度較高，不利于霉菌的繁殖，進入儲存階段，隨著溫度下降，霉菌便得以繁殖。具體來看，中溫曲中的霉菌先上升后持續(xù)下降，最高時達到1.1×106cfu/g，儲存至5個月時中溫曲的霉菌數(shù)量降低至5.58×105cfu/g，與糖化力的變化趨勢（圖2）相吻合，說明儲存期糖化力的高低與霉菌的數(shù)量呈正相關。高溫曲的霉菌數(shù)量最高為1.35×105cfu/g，經(jīng)過5個月儲存后降至5.75×104cfu/g。由圖2可知，外購高溫曲2的糖化力處于較為理想水平，據(jù)此可初步將高溫大曲霉菌的數(shù)量定為不超過2.1×105cfu/g即可。

大曲中含有的酵母種類和數(shù)量都很多，其中釀酒酵母是白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株，是酒精發(fā)酵的主要動力[13]，另外還包括很多產(chǎn)酯酵母、產(chǎn)香酵母等等。大曲在儲存時期的酵母數(shù)量變化情況如圖8所示，由圖8可知，在大曲儲存的前期酵母數(shù)量有小幅度的上升，在隨后的儲存過程中，隨著儲存期的延長，其酵母菌的數(shù)量開始下降，且下降趨勢越來越明顯，外購高溫曲在儲存期達到7個月時，僅檢測到少量酵母的存在，結合大曲發(fā)酵力變化趨勢（圖4）可以看出，隨著儲存期延長，大曲的酵母數(shù)量及酶活力均有下降趨勢，導致發(fā)酵力也隨之下降。

乳酸菌的代謝產(chǎn)物主要是乳酸，乳酸和乙醇進一步酯化可生成乳酸乙酯，乳酸乙酯是白酒中四大酯類物質(zhì)之一，因此乳酸菌也是白酒釀造過程中非常重要的一種微生物。白酒釀造過程中存在適宜的乳酸菌有利于維護釀酒環(huán)境、促進釀酒發(fā)酵、促進美拉德反應等作用[14]，但乳酸菌數(shù)量過多或者過少都對白酒的釀造不利，影響白酒口感。中高溫大曲在儲存過程中乳酸菌的變化情況如圖9所示，由圖9可知，在大曲的儲存階段，乳酸菌數(shù)量隨著儲存時間的延長呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，尤其在儲存的前2個月下降幅度很大。這表明實際儲存時，至少要超過2個月的儲存期，才可獲得相對穩(wěn)定的乳酸菌數(shù)量。外購高溫大曲1和高溫大曲2由于儲存時間超過3個月，前期變化情況無法獲知，且由于檢測到的菌數(shù)較少，導致誤差較大，但仍能反映出變化規(guī)律，即儲存3個月后乳酸菌數(shù)量仍有下降趨勢。

3　結論

為研究大曲隨著儲存時間延長的變化規(guī)律，將新出房的中溫曲和高溫曲進行儲存，每月跟蹤分析其理化指標和可培養(yǎng)微生物變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著儲存時間的延長，大曲水分酸度變化不大，進一步對可培養(yǎng)微生物種類進行分析發(fā)現(xiàn)，隨著儲存期的延長，細菌數(shù)量逐漸減少而芽孢桿菌的占有率逐步上升；霉菌、酵母菌、乳酸菌都隨著儲存期的延長而下降，糖化力指標也呈先升高后緩慢降低趨勢，液化力在前2個月時迅速降低，3個月后有所升高，然后趨于平穩(wěn)；酵母菌在初期出現(xiàn)小幅上升后也緩慢降低，相應的發(fā)酵力在前3個月時急劇下降，之后也趨于平穩(wěn)；各類微生物和理化指標變化情況在儲存3個月以后變化緩慢，并逐步趨于平穩(wěn)。

綜合考慮以上各項指標在儲存過程中的變化情況，結合大曲在白酒釀造中的作用，實際生產(chǎn)中應當注意制曲溫度和糖化力的關系，不能片面追求高糖化力，而是要求菌系、物系和酶系的平衡與協(xié)調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)大曲從剛出房至儲存的前兩個月過程中，各項理化指標和微生物指標都處在不穩(wěn)定的狀態(tài)，3個月之后才逐步趨于穩(wěn)定，且儲存期延長細菌等生酸菌逐漸減少，芽孢桿菌等有益微生物還在增加，生物酶也在不斷累積，這些都更利于白酒生產(chǎn)。據(jù)報道[15]，儲存3～4個月的大曲，其纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、酯化酶的活力均達到最佳狀態(tài)。綜合考慮所有影響因素，建議大曲最短要儲存3個月才可投入生產(chǎn)使用，其中中溫曲最好儲存超過5個月才可使用，這并不意味著大曲儲存時間越長越好。眾所周知，儲存期在12個月之內(nèi)，對出酒率影響不大，且儲存期長者，曲香好，酒質(zhì)口感更醇和。超過12個月以上的陳年老曲，曲蟲會很多，這會造成大曲淀粉的流失，甚至破壞大曲的微生物群落結構和酶系，使大曲質(zhì)量變差，嚴重影響窖內(nèi)發(fā)酵，出酒率明顯下降。且曲塊儲存期越長，其損耗越大，加之庫存占用也大，會擠壓大量資金。所以，從經(jīng)濟效益、曲塊的微生物數(shù)量及生化性能變化、釀造效果等幾個方面綜合考慮，并結合大生產(chǎn)的實踐經(jīng)驗，建議高溫大曲儲存3個月以上，中溫大曲儲存期以5個月以上為好，最長不宜超過12個月，特別是一些大曲儲存條件差的酒廠，更不宜久貯。另外，由于大曲貯存過程中各項指標（糖化力、液化力、發(fā)酵力、微生物種類及數(shù)量等等）消長不一致，故可采取不同貯存期的大曲相互搭配調(diào)節(jié)使用的方式。

值得注意的是本研究采用的是傳統(tǒng)的稀釋平板法測定大曲中微生物的數(shù)量，這種方法受到很多因素的影響，如溫度、濕度，另外還存在樣品均勻度差異和操作人員差異等因素，故計數(shù)的重復性較差，雖不能精確反映微生物在大曲中的數(shù)量，但卻可以大致反映大曲儲存過程中微生物的生長趨勢和規(guī)律。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，我們將采用高通量測序以及熒光定量的方法對微生物數(shù)量和種類進行更準確的研究，這也是我們今后的研究方向之一。

參考文獻：

[1]路星,相里加雄.汾酒大曲與普通清香型大曲釀酒性能對比[J].釀酒,2014,41(4)：53-56.

[2]沈才洪,許德富.千錘百煉鑄造國窖大曲水火交融釀制國窖 1573[J].釀酒科技,2002(1)：97-98.

[3]FAN W L,QIAN M C.Headspace solid phase microextraction and gas chromatography-olfactometry dilution analysis of young and aged Chinese“Yanghe Daqu”liquors[J].Journal of agricultural and food chemistry,2005,53(20)：7931-7938.

[4]沈才洪,應鴻,許德富,等.大曲的理化指標特征探討[J].釀酒科技,2005(9)：20-22.

[5]肖美蘭,劉建文,吳生文.特香型大曲儲存過程中幾個理化指標的變化分析[J].釀酒,2013(5)：48-50.

[6]聶凌鴻,樊璐,季方.大曲中細菌和酵母菌的分離及其Biolog微生物系統(tǒng)分析鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(2)：1036-1038.

[7]聶慧芳,蔣英麗,沈毅,等.醬香型大曲中高產(chǎn)蛋白酶細菌的分離鑒定[J].釀酒科技,2015(12)：41-44.

[8]YAN Z,HAN B Z,NOUT M J R.Monitoring the ecology ofBacillusduring Daqu incubation,a fermentation starter,using culture-dependent and culture-independent methods[J].Microbiol biotechn,2013,23(5)：614-622.

[9]ZHANG R,WU Q,XU Y.Aroma characteristics of Moutai-flavour liquor produced withBacillus licheniformisby solid-state fermentation[J].Letters in applied microbioloy,2013,57(1)：11-18.

[10]楊濤,梁明鋒,李國友,等.微生物技術在醬香型白酒生產(chǎn)中的應用研究[J].釀酒科技,2011(4)：20-28.

[11]梁麗文,繆禮鴻,楊團元,等.濃醬兼香型白酒不同儲存期的高溫大曲微生物群落結構與發(fā)酵特征分析[J].釀酒科技,2016(7)：37-41.

[12]王世寬,潘明,徐艷麗,等.濃香型大曲發(fā)酵過程中霉菌消長情況的研究[J].中國釀造,2010,29(1)：42-45.

[13]孟醒,吳群,徐巖.釀酒酵母與地衣芽孢桿菌相互作用及基于蛋白組學的作用機制分析[J].微生物學通報,2015,42(9)：1679-1688.

[14]謝玉球,鐘雨,謝旭,等.乳酸菌在固態(tài)法白酒生產(chǎn)中的地位與作用[J].釀酒科技,2008(11)：83-86.

[15]劉建文,吳生文,朱力紅,等.特香型大曲中纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、酯化酶活力變化規(guī)律的研究[J].釀酒,2013(5)：40-42.