三種阿魏不同極性部位的抗炎活性譜效關(guān)系研究

孫佳楠，馬若婷，趙生俊，張海英,3*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830000；3.新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830000)

阿魏系傘形科(Umbelliferae)阿魏屬(FerulaL.)植物，我國(guó)目前有26種，主產(chǎn)于新疆地區(qū)[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》收錄的阿魏品種為傘形科植物新疆阿魏(FerulasinkiangensisK.M.Shen)和阜康阿魏(FerulafukanensisK.M.Shen)，其藥用部位是樹脂[2]。阿魏始載于《新修本草》，被列為中品[3]，載有消積、殺蟲等功效。阿魏屬植物含有多種活性化學(xué)成分，主要包括香豆素類、倍半萜類、含硫化合物等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，阿魏具有抗炎、抗過敏、抗菌、抗腫瘤、抗?jié)兗敖獐d鎮(zhèn)痛等藥理作用[4]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者[5-7]研究發(fā)現(xiàn)，阿魏有明確的抗炎作用，但其抗炎作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明晰。中藥譜效關(guān)系是指以中藥指紋圖譜為基礎(chǔ)，以中藥藥效學(xué)為主要內(nèi)容，應(yīng)用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析和整合，建立指紋圖譜與療效之間的關(guān)系[8-9]。通過對(duì)“譜”與“效”相互作用關(guān)系的研究，揭示不同種中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。作者所在課題組前期已完成小鼠耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)新疆阿魏、阜康阿魏、多傘阿魏等3種阿魏乙醇提取物均對(duì)小鼠耳腫脹造成的急性炎癥有一定的抑制作用。在此基礎(chǔ)上，作者建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型，以LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生的NO含量為主要藥效指標(biāo)[10-11]，通過雙變量Pearson相關(guān)分析法進(jìn)行譜效關(guān)系研究，擬篩選出3種阿魏的抗炎活性部位。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

新疆阿魏(FerulasinkiangensisK.M.Shen)(2018年4月采集于伊寧縣拜石墩)、阜康阿魏(FerulafukanensisK.M.Shen)(2018年4月采集于阜康市紫泥泉鎮(zhèn))、多傘阿魏(Ferulaferulaeoides)(2018年4月采集于石河子南山)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定符合《中國(guó)植物志》[12]的記載；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

石油醚(60～90 ℃，批號(hào)20170518)，分析純，百世化工有限公司；二氯甲烷(批號(hào)20150817)、正丁醇(批號(hào)20160216)，分析純，河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；乙酸乙酯(批號(hào)2018032014)，分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑廠；水飽和正丁醇；脂多糖(LPS，批號(hào)L-2880)、二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)67685TT)、MTT(批號(hào)EZ2811D347)，美國(guó) Sigma 公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，批號(hào)AC10257442)、青霉素/鏈霉素溶液(批號(hào)J170016)、胎牛血清(FBS，批號(hào)F160123)，美國(guó) Hyclone 公司；改良型RPMI-1640完全培養(yǎng)基(批號(hào)AD16192263)，美國(guó) Gibco公司；NO檢測(cè)試劑盒(S0021-Griess試劑，批號(hào)052218180906)，碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

AL 204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Waters2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters；ZHJH-C1112B型超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)；IX71-12FL/PH型倒置熒光顯微鏡，Olympus公司；S-79943型全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(Multiskan酶標(biāo)儀)、二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó) Thermo 公司。

1.2 3種阿魏不同極性部位提取物的制備

將阿魏根切碎晾干，用5 倍體積的95%乙醇回流提取3次，每次2 h；過濾，合并濾液，于70～85 ℃水浴鍋蒸干，待無(wú)醇味即得乙醇提取物稠浸膏。將乙醇提取物稠浸膏用硅藻土拌樣，按極性從小到大依次加入5倍體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、蒸餾水，超聲提取30 min(頻率53 kHz、功率250 W，下同)，每個(gè)極性部位提取5次；將濾液減壓濃縮，蒸干，即得不同極性部位干浸膏。除石油醚部位采用70 ℃水浴蒸干外，其它各部位均采用100 ℃快速水浴蒸干除溶劑。

1.3 3種阿魏不同極性部位對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的抗炎實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗)中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，次日換液。

1.3.2 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)·mL-1，接種于96孔板中，每孔 100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入濃度梯度為25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1的陽(yáng)性對(duì)照藥物地塞米松溶液100 μL；作用4 h后加入100 μL 5 μg·mL-1LPS，與細(xì)胞共同孵育24 h。每種濃度設(shè)6個(gè)平行對(duì)照孔。

1.3.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)·mL-1，接種于96孔板中，每孔 100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?？瞻捉M(無(wú)細(xì)胞，僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基)、正常對(duì)照組吸取上清液后每孔加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基100 μL；各處理組吸棄上清液后分別加入含3種阿魏不同極性部位提取物的RPMI-1640完全培養(yǎng)基100 μL，濃度(μg·mL-1)分別為200、100、50、25、12.5、6.25。每組6個(gè)復(fù)孔，給藥后培養(yǎng)24 h，每孔加入100 μL稀釋好的MTT檢測(cè)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.3.4 Griess試劑法檢測(cè)細(xì)胞上清液NO含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)·mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；細(xì)胞貼壁后，棄上清液，分為正常對(duì)照組、LPS對(duì)照組、樣品處理組。正常對(duì)照組加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基200 μL；LPS對(duì)照組加入含5 μg·mL-1LPS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基200 μL；樣品處理組：經(jīng)前期MTT比色法篩選濃度，每孔加入3種阿魏不同極性部位提取物藥液100 μL，每種藥液稀釋成3個(gè)濃度，作用4 h后每孔加入5 μg·mL-1LPS 100 μL。每組6個(gè)復(fù)孔，孵育24 h，收集上清液，采用Griess試劑法檢測(cè)細(xì)胞上清液NO含量。

1.4 3種阿魏的HPLC分析

1.4.1 色譜條件

流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～25 min，25%～40%A；25～35 min，40%A；35～55 min，50%A；55～100 min，45%～80%A。流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2 供試溶液的制備

精密稱取3種阿魏不同極性部位提取物各0.2 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，精密稱定其質(zhì)量，超聲30 min，待冷卻后，用甲醇補(bǔ)充減失的質(zhì)量，過0.45 μm濾膜，即得供試溶液。

1.4.3 譜效關(guān)系分析

對(duì)3種阿魏不同極性部位提取物的HPLC主要色譜峰峰面積分析數(shù)據(jù)與同一濃度下NO含量進(jìn)行分析，研究?jī)烧叩南嚓P(guān)性。另外，將具有顯著相關(guān)性的色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜、紫外光譜、氫譜、碳譜進(jìn)行對(duì)照，進(jìn)行化合物初步鑒定。

1.5 相關(guān)性分析

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型的建立

地塞米松溶液對(duì)細(xì)胞活力和NO濃度的影響見表1。

表1 地塞米松溶液對(duì)細(xì)胞活力和NO濃度的影響(n=6)Tab.1 Effect of Dexamethasone solution on cell viability and NO concentration(n=6)

由表1可知，與LPS對(duì)照組比較，地塞米松各濃度處理組的NO濃度均非常顯著降低(P<0.01)，并具有劑量依賴性；LPS對(duì)照組的NO濃度遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組，表明小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型成功建立，且穩(wěn)定性較好。

2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果

采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算3種阿魏不同極性部位的細(xì)胞存活率(表2～4)，各篩選出3個(gè)濃度：95%乙醇提取物濃度梯度為50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1；石油醚部位濃度梯度為25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1；二氯甲烷部位濃度梯度為12.5 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、3.125 μg·mL-1；乙酸乙酯部位濃度梯度為50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1；水飽和正丁醇部位濃度梯度為25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1；水部位濃度梯度為50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1。

表2 新疆阿魏不同極性部位的細(xì)胞存活率Tab.2 Cell survival rate of different polar extracts of Ferula sinkiangensis K.M.Shen

表3 阜康阿魏不同極性部位的細(xì)胞存活率Tab.3 Cell survival rate of different polar extracts of Ferula fukanensis K.M.Shen

表4 多傘阿魏不同極性部位的細(xì)胞存活率Tab.4 Cell survival rate of different polar extracts of Ferula ferulaeoides

2.3 3種阿魏不同極性部位提取物的抗炎活性

2.3.1 3種阿魏95%乙醇提取物對(duì)NO濃度的影響(表5)

由表5可知，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)3種阿魏95%乙醇提取物作用24 h后，經(jīng)5 μg·mL-1LPS刺激，能夠釋放出大量NO，與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；與LPS對(duì)照組比較，3種阿魏各濃度95%乙醇提取物處理組的NO濃度均非常顯著降低(P<0.01)，表明3種阿魏95%乙醇提取物均有一定的抗炎活性。

2.3.2 3種阿魏石油醚部位對(duì)NO濃度的影響(表6)

由表6可知，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)3種阿魏石油醚部位作用24 h后，經(jīng)5 μg·mL-1LPS刺激，能夠釋放出大量NO，與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；與LPS對(duì)照組比較，阜康阿魏石油醚部位高濃度(25 μg·mL-1)處理組的NO濃度顯著降低(P<0.05)，其余濃度均無(wú)明顯變化。表明，阜康阿魏石油醚部位有一定的抗炎活性，新疆阿魏、多傘阿魏石油醚部位可能無(wú)抗炎活性。

2.3.3 3種阿魏二氯甲烷部位對(duì)NO濃度的影響(表7)

表7 3種阿魏二氯甲烷部位對(duì)NO濃度的影響(n=6)Tab.7 Effect of methylene chloride extract of three kinds of Ferula on NO concentration(n=6)

由表7可知，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)3種阿魏二氯甲烷部位作用24 h后，經(jīng)5 μg·mL-1LPS刺激，能夠釋放出大量NO，與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；與LPS對(duì)照組比較，新疆阿魏二氯甲烷部位高濃度(12.5 μg·mL-1)處理組的NO濃度非常顯著降低(P<0.01)，阜康阿魏、多傘阿魏二氯甲烷部位高濃度(12.5 μg·mL-1)、中濃度(6.25 μg·mL-1)處理組的NO濃度均非常顯著降低(P<0.01)。表明，3種阿魏二氯甲烷部位均有一定的抗炎活性。

2.3.4 3種阿魏乙酸乙酯部位對(duì)NO濃度的影響(表8)

由表8可知，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)3種阿魏乙酸乙酯部位作用24 h后，經(jīng)5 μg·mL-1LPS刺激，能夠釋放出大量NO，與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；與LPS對(duì)照組比較，新疆阿魏乙酸乙酯部位高濃度(50 μg·mL-1)、中濃度(25 μg·mL-1)處理組的NO濃度均非常顯著降低(P<0.01)，阜康阿魏乙酸乙酯部位各濃度處理組的NO濃度均非常顯著降低(P<0.01)，多傘阿魏乙酸乙酯部位高濃度(50 μg·mL-1)、中濃度(25 μg·mL-1)處理組的NO濃度均非常顯著降低(P<0.01)。表明，3種阿魏乙酸乙酯部位均有一定的抗炎活性。

表8 3種阿魏乙酸乙酯部位對(duì)NO濃度的影響(n=6)Tab.8 Effect of ethyl acetate extract of three kinds of Ferula on NO concentration(n=6)

2.3.5 3種阿魏水飽和正丁醇部位對(duì)NO濃度的影響(表9)

表9 3種阿魏水飽和正丁醇部位對(duì)NO濃度的影響(n=6)Tab.9 Effect of water-saturated butanol extract of three kinds of Ferula on NO concentration(n=6)

由表9可知，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)3種阿魏水飽和正丁醇部位作用24 h后，經(jīng)5 μg·mL-1LPS刺激，能夠釋放出大量NO，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)；與LPS對(duì)照組比較，多傘阿魏水飽和正丁醇部位高濃度(25 μg·mL-1)、中濃度(12.5 μg·mL-1)處理組的NO濃度均非常顯著降低(P<0.01)，其它處理組無(wú)明顯變化。表明，新疆阿魏、阜康阿魏水飽和正丁醇部位無(wú)明顯抗炎活性，多傘阿魏水飽和正丁醇部位有一定的抗炎活性。

2.3.6 3種阿魏水部位對(duì)NO濃度的影響(表10)

表10 3種阿魏水部位對(duì)NO濃度的影響(n=6)Tab.10 Effect of water extract of three kinds of Ferula on NO concentration(n=6)

由表10可知，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)3種阿魏水部位作用24 h后，經(jīng)5 μg·mL-1LPS刺激后，能夠釋放出大量NO，與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；與LPS對(duì)照組比較，3種阿魏水部位處理組的NO濃度無(wú)明顯變化。表明，3種阿魏水部位沒有抗炎活性。

2.4 3種阿魏不同極性部位的HPLC分析(圖1)

圖1 新疆阿魏(a)、阜康阿魏(b)、多傘阿魏(c)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of Ferula sinkiangensis K.M.Shen(a),Ferula fukanensis K.M.Shen(b),and Ferula ferulaeoides(c)

3種阿魏不同極性部位各色譜峰所代表的化學(xué)成分的種類及含量有明顯的差異性。為了進(jìn)行直觀的觀察，列舉出每種阿魏主要色譜峰的峰面積，結(jié)果見表11～13。

表11 新疆阿魏HPLC圖譜中主要色譜峰的峰面積Tab.11 Peak areas of main chromatographic peaks in HPLC spectrum of Ferula sinkiangensis K.M.Shen

表12 阜康阿魏HPLC圖譜中主要色譜峰的峰面積Tab.12 Peak areas of main chromatographic peaks in HPLC spectrum of Ferula fukanensis K.M.Shen

表13 多傘阿魏HPLC圖譜中主要色譜峰的峰面積Tab.13 Peak areas of main chromatographic peaks in HPLC spectrum of Ferula ferulaeoides

2.5 3種阿魏不同極性部位的HPLC圖譜與NO含 量的相關(guān)分析結(jié)果(表14～16)

表14 新疆阿魏HPLC圖譜中主要色譜峰變量與NO含量的相關(guān)分析Tab.14 Correlation analysis between main chromatographic peak variables in HPLC spectrum of Ferula sinkiangensis K.M.Shen and NO content

由表14～16可知，3種阿魏除在保留時(shí)間8.5 min處的色譜峰外，其余主要色譜峰變量與NO含量之間呈負(fù)相關(guān)。新疆阿魏在保留時(shí)間40 min、68 min、75 min、78 min處的色譜峰變量與NO含量具有顯著負(fù)相關(guān)性；阜康阿魏在保留時(shí)間38 min、40 min、65 min、68 min、75 min、86 min處的色譜峰變量與NO含量具有顯著負(fù)相關(guān)性，其中68 min處具有非常顯著相關(guān)性；多傘阿魏在保留時(shí)間35 min、86 min處的色譜峰變量與NO含量具有顯著負(fù)相關(guān)性。具有顯著負(fù)相關(guān)性的色譜峰代表的化學(xué)成分可能是3種阿魏的主要抗炎活性成分。

表15 阜康阿魏HPLC圖譜中主要色譜峰變量與NO含量的相關(guān)分析Tab.15 Correlation analysis between main chromatographic peak variables in HPLC spectrum of Ferula fukanensis

表16 多傘阿魏HPLC圖譜中主要色譜峰變量與NO含量的相關(guān)分析Tab.16 Correlation analysis between main chromatographic peak variables in HPLC spectrum of Ferula ferulaeoides and NO content

2.6 化合物結(jié)構(gòu)的初步鑒定

基于課題組前期對(duì)新疆阿魏樹脂進(jìn)行化合物單體的分離和結(jié)構(gòu)解析，經(jīng)單體HPLC圖譜、紫外光譜、氫譜、碳譜進(jìn)行對(duì)照，將新疆阿魏和阜康阿魏在保留時(shí)間68 min、75 min處及阜康阿魏和多傘阿魏在保留時(shí)間86 min處具有顯著抗炎活性的共有色譜峰分別鑒定為化合物fekrynol(托里阿魏諾醇)、lehmannolol(大果阿魏醇)和lehmannolone(大果阿魏酮)，其氫譜及碳譜數(shù)據(jù)如下：

化合物fekrynol：1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:1.17(2H,m,H-1′),1.53(1H,m,H-2′a),1.84(1H,m,H-2′b),3.61(2H,t,J=5.6 Hz,H-3′),1.88(1H,m,H-6′a),2.47(1H,d,J=12.8 Hz,H-6′b),1.39(2H,m,H-7′),1.23(1H,m,H-8′),2.89(1H,dd,J=10.8 Hz、4.4 Hz,H-10′),3.67(1H,d,J=8.4 Hz,H-11′a),3.86(1H,d,J=8.4 Hz,H-11′b),0.87(3H,d,J=6.8 Hz,H-12′),1.43(3H,s,H-13′),1.59(3H,s,H-14′),1.10(3H,s,H-15′),6.20(1H,d,J=9.2 Hz,H-3),7.60(1H,d,J=9.6 Hz,H-4),7.31(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),6.78(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.73(1H,brs,H-8);13CNMR(CDCl3,100 MHz),δ:161.2(C-2),112.8(C-3),143.4(C-4),128.4(C-5),113.0(C-6),162.8(C-7),101.1(C-8),155.8(C-9),112.1(C-10),22.4(C-1′),30.7(C-2′),63.4(C-3′),124.8(C-4′),130.3(C-5′),24.4(C-6′),32.0(C-7′),34.7(C-8′),40.7(C-9′),43.0(C-10′),71.7(C-11′),16.0(C-12′),20.1(C-13′),20.2(C-14′),22.4(C-15′)。

化合物lehmannolol：1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:1.51(1H,ov,H-1′a),2.03(1H,m,H-1′b),1.29(1H,ov,H-2′a),2.08(1H,m,H-2′b),3.37(1H,td,J=10.4 Hz、5.6 Hz,H-3′),1.11(1H,m,H-4′),1.29(1H,ov,H-6′a),1.45(1H，ov,H-6′b),1.93(1H,m,H-7′a),1.29(1H,m,H-7′b),1.79(1H,m,H-8′),3.71(1H,d,J=8.8 Hz,H-11′a),3.64(1H,d,J=8.8 Hz,H-11′b),0.92(3H,d,J=7.0 Hz,H-12′),0.93(3H,d,J=7.0 Hz,H-13′),0.85(3H,s,H-14′),1.05(3H,s,H-15′),6.21(1H,d,J=9.6 Hz,H-3),7.60(1H,d,J=9.2 Hz,H-4),7.33(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.81(1H,d,J=8.4 Hz,H-6),6.78(1H,brs,H-8);13CNMR(CDCl3,100 MHz),δ:161.1(C-2),112.9(C-3),143.3(C-4),128.6(C-5),112.9(C-6),162.4(C-7),101.4(C-8),155.8(C-9),112.3(C-10),20.9(C-1′),36.3(C-2′),71.6(C-3′),52.8(C-4′),37.8(C-5′),32.4(C-6′),25.1(C-7′),35.3(C-8′),39.0(C-9′),44.5(C-10′),76.0(C-11′),14.7(C-12′),9.8(C-13′),14.1(C-14′),19.9(C-15′)。

化合物lehmannolone：1HNMR(CDCl3,400 MHz),δ:1.75～1.88(2H,m,H-1′),2.26～2.38(2H,m,H-2′),2.27(1H,ov,H-4′),1.48(1H,m,H-6′a),1.39(1H,m,H-6′b),1.92(1H,m,H-7′a),1.37(1H,m,H-7′b),1.85(1H,m,H-8′),2.04(1H,dd,J=11.5 Hz、4.4 Hz,H-10′),3.73(2H,m,H-11′),0.98(3H,d,J=6.8 Hz,H-12′),0.88(3H,d,J=6.4 Hz,H-13′),0.77(3H,s,H-14′),1.07(3H,s,H-15′),6.20(1H,d,J=9.6 Hz,H-3),7.59(1H,d,J=9.2 Hz,H-4),7.31(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),6.78(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.73(1H,brs,H-8);13CNMR(CDCl3,100 MHz),δ:161.0(C-2),113.0(C-3),143.2(C-4),128.6(C-5),112.8(C-6),162.1(C-7),101.3(C-8),155.8(C-9),112.5(C-10),23.5(C-1′),41.3(C-2′),212.0(C-3′),58.0(C-4′),41.6(C-5′),32.2(C-6′),25.3(C-7′),35.6(C-8′),39.4(C-9′),43.9(C-10′),75.8(C-11′),14.7(C-12′),6.7(C-13′),14.4(C-14′),19.9(C-15′)。

化合物fekrynol、lehmannolol和lehmannolone的結(jié)構(gòu)式、HPLC圖譜和紫外光譜分別見圖2～4。

圖2 化合物fekrynol、lehmannolol、lehmannolone的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formulas of compounds fekrynol,lehmannolol,and lehmannolone

圖3 新疆阿魏95%乙醇提取物(a)、fekrynol(b)、lehmannolol(c)、lehmannolone(d)的HPLC圖譜Fig.3 HPLC spectra of 95% ethanol extract of Ferula sinkiangensis K.M.Shen(a),fekrynol(b),lehmannolol(c),and lehmannolone(d)

a、c、e為對(duì)照品 b、d、f為樣品

2.7 討論

巨噬細(xì)胞為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的激活能夠造成炎癥反應(yīng)。當(dāng)LPS作用于巨噬細(xì)胞時(shí)可通過激活TLR4受體來(lái)激活NF-κB和MAPK炎性信號(hào)通路，進(jìn)而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)NO合成酶分泌出大量的NO，從而發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7作為體外炎癥模型來(lái)篩選3種阿魏的抗炎活性部位。

3種阿魏不同極性部位提取物的化學(xué)成分尚不明確，通過建立相應(yīng)的HPLC圖譜，將其主要色譜峰變量與NO含量經(jīng)過雙變量Pearson相關(guān)分析，篩選出阿魏提取物中與NO含量指標(biāo)相關(guān)的變量。在3種阿魏不同極性部位提取物中僅有阜康阿魏在保留時(shí)間8.5 min處的色譜峰與NO含量之間呈顯著正相關(guān)，其具體成分是否具有致炎性，需要進(jìn)一步探究。其余主要色譜峰變量與NO含量之間呈負(fù)相關(guān)，即表現(xiàn)為峰面積值越大，其對(duì)應(yīng)NO含量值越小，推測(cè)其化學(xué)成分的含量差異性直接影響其抗炎藥理指標(biāo)；新疆阿魏和阜康阿魏在保留時(shí)間68 min、75 min處的色譜峰及阜康阿魏和多傘阿魏在保留時(shí)間86 min處的色譜峰均具有顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，初步判斷相關(guān)成分分別為fekrynol、lehmannolol及l(fā)ehmannolone；其它同樣具有顯著負(fù)相關(guān)的色譜峰，由于未找到對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，目前沒有鑒定出其化學(xué)成分，待后期進(jìn)一步研究。

本研究中，3種阿魏95%乙醇提取物、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位均有顯著抗炎活性，3種阿魏水部位均無(wú)明顯抗炎活性，其中阜康阿魏的石油醚部位和多傘阿魏的水飽和正丁醇部位也有一定抗炎活性。阿魏的抗炎活性成分多為香豆素類成分，國(guó)內(nèi)學(xué)者[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，新疆阿魏樹脂的三氯甲烷提取物能明顯抑制神經(jīng)炎癥，多傘阿魏中提取的倍半萜-香豆素雜合化合物對(duì)誘導(dǎo)性NO合成酶活性具有抑制作用。國(guó)外學(xué)者[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，從阿魏屬植物根部提取的umbelliprenin(傘形戊烯內(nèi)酯,UMB)成分通過體外抑制脂氧合酶從而控制炎癥反應(yīng)，在體內(nèi)則具有抗炎活性。在炎性巨噬細(xì)胞中，UMB能抑制NO的產(chǎn)生和誘導(dǎo)性NO合成酶的生成。

綜上，本研究鑒定的單體化合物fekrynol是單環(huán)倍半萜香豆素類，lehmannolol及l(fā)ehmannolone是雙環(huán)倍半萜香豆素類，對(duì)阿魏的抗炎活性與以往報(bào)道的阿魏屬植物及其衍生物的抗炎活性一致。

3 結(jié)論

建立LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型，采用Griess 試劑法檢測(cè)NO含量，通過雙變量Pearson相關(guān)分析法，將新疆阿魏、阜康阿魏、多傘阿魏不同極性部位的HPLC圖譜與NO含量進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出3種阿魏的抗炎活性部位。結(jié)果表明，3種阿魏95%乙醇提取物、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位均有顯著抗炎活性(P<0.01或P<0.05)，3種阿魏水部位均無(wú)明顯抗炎活性；新疆阿魏和阜康阿魏在保留時(shí)間68 min、75 min處及阜康阿魏和多傘阿魏在保留時(shí)間86 min處具有顯著抗炎活性的共有色譜峰分別為化合物fekrynol(托里阿魏諾醇)、lehmannolol(大果阿魏醇)和lehmannolone(大果阿魏酮)，其可能是阿魏的抗炎活性成分。