有機(jī)氯農(nóng)藥的微生物降解

商文賢，徐宏英，王俊偉，張 嬋

(太原科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030024)

有機(jī)氯農(nóng)藥(organochlorine pesticides，OCPs)是我國上世紀(jì)廣泛使用的殺蟲劑，主要以苯和環(huán)戊二烯為原料合成。我國使用最多和最廣的殺蟲劑為滴滴涕、六六六、氯丹、七氯和百菌清等。有機(jī)氯農(nóng)藥在土壤中的殘留時(shí)間長，且降解困難，累積在動(dòng)植物體內(nèi)，最終通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康。我國雖然在1983年禁止生產(chǎn)滴滴涕和六六六等有機(jī)氯農(nóng)藥，但因其在環(huán)境中的穩(wěn)定性、持久性及其使用的廣泛性，大量的有機(jī)氯農(nóng)藥仍殘留在環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成較大的威脅。生物修復(fù)技術(shù)操作簡單、成本低、無二次污染，是一種高效經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保的技術(shù)，有機(jī)氯農(nóng)藥降解微生物的篩選技術(shù)和相關(guān)降解理論的研究已相對(duì)成熟。作者介紹了近年來我國有機(jī)氯農(nóng)藥的污染現(xiàn)狀，重點(diǎn)總結(jié)了國內(nèi)外5種主要有機(jī)氯農(nóng)藥的微生物降解方面的研究進(jìn)展及其降解酶和降解基因，為生物修復(fù)有機(jī)氯農(nóng)藥污染環(huán)境提供借鑒。

1 我國有機(jī)氯農(nóng)藥的污染現(xiàn)狀

研究人員對(duì)國內(nèi)有機(jī)氯農(nóng)藥的污染現(xiàn)狀進(jìn)行了大量研究。李子成等[1]對(duì)丹江口水庫遷建區(qū)土壤進(jìn)行有機(jī)氯農(nóng)藥檢測，結(jié)果表明，總有機(jī)氯農(nóng)藥含量為ND～249.37 ng·g-1，平均值為24.82 ng·g-1；其中，滴滴涕與六六六的含量較高，分別為ND～104.53 ng·g-1和ND～69.68 ng·g-1。張家泉等[2]研究發(fā)現(xiàn)，閩江干流沿岸土壤中總有機(jī)氯農(nóng)藥含量為4.31～877.80 ng·g-1，平均值為74.13 ng·g-1；且閩江干流沿岸土壤及河口沉積物中滴滴涕含量高于六六六的，滴滴涕含量為1.67～876.49 ng·g-1，平均值為66.64 ng·g-1，六六六含量為1.32～24.01 ng·g-1，平均值為7.50 ng·g-1。受傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)用地及農(nóng)藥化工企業(yè)分布的影響，閩江干流下游土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥含量分布呈非均一性，沉積物樣品中滴滴涕和六六六的含量分別為1.12～31.04 ng·g-1、0.34～11.72 ng·g-1，分析發(fā)現(xiàn)該地區(qū)近年來滴滴涕仍有輸入，這可能與滴滴涕的替代品——三氯殺螨醇的使用有關(guān)。史雙昕等[3]對(duì)北京地區(qū)土壤中持久性有機(jī)污染物(POPs)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)六氯苯、滴滴涕的檢出率很高，狄氏劑、異狄氏劑、七氯和滅蟻靈均未檢出，總有機(jī)氯農(nóng)藥類POPs含量平均值為77.7 ng·g-1；其中，滴滴涕占比高達(dá)98.9%，是北京地區(qū)土壤中有機(jī)氯農(nóng)藥類POPs的主要成分，其中城市公園和園林土壤是其主要污染源；六氯苯是北京地區(qū)土壤中普遍存在的另一類POPs，但其殘留量很低，同樣氯丹的檢出率也很低，兩者沒有對(duì)土壤造成危害。蘧丹等[4]以重慶某廢棄有機(jī)氯農(nóng)藥場地及其周邊為研究區(qū)域，分析土壤中滴滴涕、六六六及其降解產(chǎn)物的含量水平，結(jié)果表明，場地土壤中滴滴涕含量為22.74～11 186.10 ng·g-1，六六六含量為3.89～13 385.78 ng·g-1，低于國內(nèi)已報(bào)道的其它污染場地。Wang等[5]對(duì)北京10所高校校園的土壤樣品進(jìn)行了分析，確定了15種有機(jī)氯農(nóng)藥；滴滴涕是主要污染物，占總有機(jī)氯農(nóng)藥含量的93.70%，其次是六氯己烷(2.25%)和六氯苯(1.82%)，氯丹、七氯和硫丹分別占15種有機(jī)氯農(nóng)藥含量的0.51%、1.05%和0.79%。張靜靜[6]研究發(fā)現(xiàn)，長春市城郊菜地土壤中，滴滴涕和六六六是最主要的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，兩者共占有機(jī)氯農(nóng)藥殘留總量的88.29%，各種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量由多到少的順序依次為滴滴涕>六六六>氯丹>狄氏劑>艾氏劑。

2 微生物對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥的降解

2.1 滴滴涕的微生物降解

Chandrappa等[7]采用富集方法從未受滴滴涕污染的熱帶土壤中篩選得到數(shù)株分屬于Bacillus、Staphylococcus及Stenotrophomonas的菌株，其能以滴滴涕為唯一碳源，且其31 d對(duì)滴滴涕的降解率為28.48%～58.08%。高晶晶[8]從巢湖周邊受滴滴涕污染嚴(yán)重的土壤中篩選得到1株滴滴涕降解菌Alcaligenessp.DX8，其3 d對(duì)滴滴涕的降解率可達(dá)到54.83%。茅燕勇等[9]對(duì)洪澤湖濕地淤泥進(jìn)行研究，從中篩選獲得1株高效滴滴涕降解菌Bacilluscereus2D-1，在最適條件(33 ℃、pH值6.5)下培養(yǎng)8 d后，其對(duì)滴滴涕的降解率達(dá)到95.64%。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，白腐菌漆酶能有效降解滴滴涕，對(duì)滴滴涕的降解符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)；不同漆酶用量土壤中滴滴涕的殘留量在培養(yǎng)5 d、10 d、15 d和25 d后分別下降了21%～32%、29%～45%、35%～51%和36%～51%。李紅權(quán)等[11]從滴滴涕污染的土壤中篩選得到1株寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)菌株，在培養(yǎng)溫度為30 ℃、底物質(zhì)量濃度為40 mg·L-1、pH值為7.0、搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1的條件下，其10 d對(duì)滴滴涕的降解率為69.0%。申艷萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血紅密孔菌對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥的降解具有明顯的促進(jìn)作用，在未接種菌劑情況下，高溫堆肥對(duì)滴滴涕的降解率為43.6%；接種1%菌劑時(shí)，滴滴涕的降解率較未接種堆肥的提高34.6%；接種3%菌劑時(shí)，滴滴涕的降解率較未接種堆肥的提高34.6%。Qu等[13]從有機(jī)氯農(nóng)藥污染的土壤中分離得到1株能降解多種有機(jī)氯農(nóng)藥并將其作為唯一碳源和能源生長的金桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)PYR2菌株，其在30 d內(nèi)對(duì)滴滴涕異構(gòu)體(50 mg·L-1)的降解率為80%～98%；對(duì)高有機(jī)氯農(nóng)藥污染土壤進(jìn)行了中試規(guī)模的PYR2強(qiáng)化的遷地生物修復(fù)研究，在45 d的試驗(yàn)期內(nèi)，施用PYR2(35.37 mg·kg-1)的土壤中滴滴涕濃度降低了80.3%，而對(duì)照土壤僅降低了57.6%。

2.2 六六六的微生物降解

趙煜坤等[14]用六六六降解菌BHC-A處理盆缽?fù)寥溃?0 d后土壤中六六六降解率達(dá)到89.07%，20 d后六六六降解率達(dá)到98.93%。李名星[15]研究發(fā)現(xiàn)，菌株BHC-C在12 h內(nèi)對(duì)α-六六六的降解率為60.1%，對(duì)β-六六六的降解率為30.2%，對(duì)γ-六六六的降解率為100%，對(duì)δ-六六六的降解率為38.6%。張明星等[16]將降解菌 BHC-A添加到土壤中，7 d后六六六的降解率為86.16%，殘留量為0.31 mg·kg-1；15 d后六六六降解率達(dá)到90.18%，殘留量降至0.22 mg·kg-1，其含量符合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。Johri等[17]研究發(fā)現(xiàn)，少動(dòng)鞘胺醇單胞菌3 d就能完全降解5 mg·L-1的α-六六六，在12 d內(nèi)對(duì)β-六六六、γ-六六六的降解率均達(dá)到98%，對(duì)δ-六六六的降解最慢。Singh等[18]研究發(fā)現(xiàn)，白腐菌在 28 d對(duì) 78 mg·L-1的六六六的降解率高達(dá)100%。de Paolis等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Arthrobactersp.72 h后對(duì)α-六六六的降解率為88%，對(duì)β-六六六的降解率為60%，對(duì)γ-六六六的降解率為56%。肖鵬飛等[20]研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑Tween80 濃度為1.0 g·L-1時(shí)，白腐真菌對(duì)六六六的降解率達(dá)到最高，為86.38%。申艷萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在未接種菌劑情況下，高溫堆肥對(duì)六六六的降解率為51.1%；接種1%菌劑時(shí)，六六六的降解率較未接種堆肥的提高16.2%；接種3%菌劑時(shí)，六六六的降解率較未接種堆肥的提高41.1%。

2.3 氯丹的微生物降解

楊東璇等[21]研究發(fā)現(xiàn)，白腐真菌能有效降解土壤中的氯丹，其最適溫度為25～35 ℃、最適pH值為4～6；在合適的溫度和pH 值下，白腐真菌對(duì)100 mg·L-1氯丹的30 d平均降解速率最高為1.71 mg·kg-1·d-1。Hirano等[22]利用河底淤泥中的微生物，在已充滿氮?dú)獾膮捬鯒l件下降解濃度均為0.025 mg·L-1的順式氯丹和反式氯丹的混合物，140 d后發(fā)現(xiàn)，順式氯丹降解率為12%，反式氯丹降解率為33%。Petruska等[23]采用好氧堆肥的方法進(jìn)行氯丹的降解實(shí)驗(yàn)，21 d后氯丹降解率達(dá)到49.6%。黨立晨[24]用Enterobactersp.LY402對(duì)氯丹進(jìn)行降解，發(fā)現(xiàn)在30 ℃經(jīng)過4 d的好氧降解，總降解率接近95%；其中，順式氯丹和反式氯丹的生物降解率沒有明顯差別。

2.4 七氯的微生物降解

肖鵬飛等[25]研究了1株木材腐朽菌及其粗酶液對(duì)七氯的降解，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)初始濃度為50 μg·L-1的七氯具有0.303 1 μmol·L-1·h-1的最大降解速率；當(dāng)接種15%菌劑時(shí)，降解速率達(dá)到最高,為0.204 5 μmol·L-1·h-1；其降解產(chǎn)物主要為1-羥基-2,3-環(huán)氧六氯、1-羥基六氯和環(huán)氧七氯。Purnomo等[26]研究了白腐真菌降解污染土壤中的七氯和環(huán)氧七氯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 28 d后七氯的降解率達(dá)到了89%。Purnomo等[27]研究發(fā)現(xiàn)，平紋假單胞菌在14 d內(nèi)完全消除了PDB培養(yǎng)基和HN培養(yǎng)基中的七氯，除氯烯和1-羥基氯烯外，還檢測到七氯環(huán)氧化物是主要的代謝產(chǎn)物。該菌株在培養(yǎng)14 d后對(duì)PDB培養(yǎng)基中的環(huán)氧七甲草醚的降解率為31%，主要代謝產(chǎn)物為2，3-二羥基七氯(七氯二醇)。

2.5 百菌清的微生物降解

Katayama等[28]從污染土壤中分離得到11株降解菌，分屬于Pseudomonas、Azomonas、Moraxella和Flavobacterium等4個(gè)屬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤中百菌清濃度的增加可以促進(jìn)百菌清降解菌數(shù)量的增長，進(jìn)而分離得到可抗高濃度百菌清的降解菌。Lal等[29]分離得到百菌清降解菌TB1，其在5 d內(nèi)不依靠其它碳源降解30 mg·L-1百菌清，產(chǎn)生4-羥基-2,3,5,6-四氯間苯二甲氰和一個(gè)單位的氯離子。Lee等[30]從污染土壤中分離得到1株百菌清降解菌Ochrobactrumsp.SH35B，在30 ℃、1/10 LB培養(yǎng)基中30 h對(duì)10 mg·L-1百菌清的降解率可達(dá)到100%。史秀珍等[31]從污染土壤中分離得到百菌清降解菌OchrobactrumlupiniTP-D1，采用硅膠薄層層析(TLC)分離、LC-MS檢測代謝產(chǎn)物，確定代謝產(chǎn)物為4-羥基-2,3,5,6-四氯間苯二甲氰和1,3-二氨甲?；?2,4,5,6-四氯苯。Yu等[32]從百菌清重復(fù)使用的土壤中分離得到1株棒狀桿菌Y1，其在培養(yǎng)14 d后對(duì)10 mg·L-1百菌清的降解率達(dá)到67.9%。Wang等[33]分離得到1株在分類地位上屬于新種的百菌清降解菌Lysobacterruisheniisp.CTN-1，其可以在無機(jī)鹽農(nóng)藥平板上形成透明降解圈。谷月[34]研究發(fā)現(xiàn)，色齒毛菌CerrnaunicolorY4941培養(yǎng)72 h后，百菌清的殘留率僅為1.92%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，硬毛粗蓋孔菌FunaliatrogiiW4289、樺褶孔菌LenzitesbetulinaY4962、藏紅硬孔菌RigidoporuscrocatusD10146、裂褶菌SchizophyllumcommuneD9466和云芝栓孔菌TrametesversicolorW4614對(duì)百菌清的降解率均可達(dá)80%以上。

表1列出了能降解以上5種主要有機(jī)氯農(nóng)藥的微生物，共涉及16個(gè)屬。

表1 國內(nèi)外降解主要有機(jī)氯農(nóng)藥的微生物Tab.1 Organochlorine pesticides-degrading microorganisms at home and abroad

2.6 有機(jī)氯農(nóng)藥的混合菌群降解

趙煜坤等[14]研究發(fā)現(xiàn)，菌株BHC-A和wax能夠?qū)λ咎锿寥乐袣埩舻牧偷蔚翁槠鸬胶芎玫男迯?fù)作用，降解率分別達(dá)到了98.93%和97.85%，且農(nóng)藥殘留的降解速率與土壤中高效降解微生物的數(shù)量呈正相關(guān)。Abraham等[48]在研究毒死蜱、有機(jī)磷和硫丹污染土壤時(shí)發(fā)現(xiàn)，微生物菌群能對(duì)其進(jìn)行高效降解，且降解產(chǎn)物為無毒代謝物。從毒死蜱污染的土壤中篩選得到Alcaligenessp.JAS1、Ochrobactrumsp.JAS2和Sphingobacteriumsp.JAS3，從有機(jī)磷污染土壤中篩選得到EnterobacterludwigiiJAS17、PseudomonasmoraviensisJAS18和SerratiamarcescensJAS16，從硫丹污染土壤中篩選得到KlebsiellapneumoniaeJAS8、EnterobactercloacaeJAS7、HalophilicbacteriaJAS4和Enterobacterasburiaestrain JAS5。Kurashvili等[49]采用微生物、植物對(duì)污染土壤進(jìn)行聯(lián)合修復(fù)，其中，利用Pseudomonassp.TBM6、Pseudomonassp.4JL50及大豆聯(lián)合修復(fù)時(shí)，土壤中的滴滴涕含量降低了80%；利用Pseudomonassp.8JL63、Pseudomonassp.TP335及玉米聯(lián)合修復(fù)五氯酚污染土壤最有效，土壤中五氯酚含量降低67%。Barragán-Huerta等[50]研究發(fā)現(xiàn)，利用綠豆、咖啡作為營養(yǎng)來源，銅綠假單胞菌(Paeruginosa)和稻瘟病菌(Foryzihabitans)可在厭氧條件下對(duì)滴滴涕和硫丹進(jìn)行降解。高亞楠[51]在新疆棉花種植地區(qū)，利用混合菌種降解土壤中的高效氯氰菊酯，結(jié)果表明，棉田土壤中能降解高效氯氰菊酯的可培養(yǎng)微生物種類較少，其中優(yōu)勢微生物是銅綠假單胞菌，占90.91%，而無色桿菌占9.09%。該菌群最適條件為：溫度27 ℃、初始pH值7.0、裝樣量200 mL。在培養(yǎng)24 h時(shí)，高效氯氰菊酯的降解率為68.81%；在培養(yǎng)132 h時(shí)，高效氯氰菊酯的降解率為 92.39%。張寧[52]利用貪銅菌(Cupriavidussp.)YNS-85和根瘤菌(Rhizobiumsp.)ZL-27組建復(fù)合菌劑，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)菌能夠共存并能同時(shí)降解溶液和土壤中的五氯硝基苯和乙草胺。在20 mg·kg-1五氯硝基苯和 30 mg·kg-1乙草胺為碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，復(fù)合菌劑3 d內(nèi)對(duì)五氯硝基苯的降解率為 65.77%，對(duì)乙草胺的降解率為 86.10%。盆栽土壤降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，40 d內(nèi)ZL-27對(duì)乙草胺的降解率為30.91%，復(fù)合菌劑對(duì)五氯硝基苯的降解率為62.72%，對(duì)乙草胺的降解率為10.23%?？傊⑸锞旱穆?lián)合作用明顯優(yōu)于單菌株的降解效果，微生物菌株之間的協(xié)同作用強(qiáng)化了有機(jī)氯農(nóng)藥的降解。這與Xu等[53]對(duì)難降解有機(jī)物多環(huán)芳烴的生物修復(fù)結(jié)果以及王曉慧[54]對(duì)高效氯氟氰菊酯的生物修復(fù)結(jié)果一致。

3 微生物降解有機(jī)氯農(nóng)藥的降解酶和降解基因

微生物降解有機(jī)氯農(nóng)藥需要多種酶的共同參與，目前發(fā)現(xiàn)有機(jī)氯農(nóng)藥的降解酶主要包括脫氯化氫酶、水解酶、脫氫酶和脫氯酶等。脫氯化氫酶是對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥底物分子上脫去氯化氫形成碳碳雙鍵的酶。Nagata等[55]在降解菌SphingomonaspaucimobilisUT26 中發(fā)現(xiàn)了無需輔助因子的由linA基因編碼的六六六脫氯化氫酶；Kumari等[56]從SphingomonaspaucimobilisB90中發(fā)現(xiàn)了需輔助因子的3-氯-D-丙氨酸-脫氯化氫酶，編碼該酶的基因linA有兩個(gè)不同副本，分別為linA1和linA2；還有學(xué)者從Muscadometistica中分離得到了需輔助因子的真核脫氯化氫酶[57]。由linB基因編碼的水解酶催化有機(jī)氯農(nóng)藥的C-Cl鍵斷裂，生成烷基-酶中間產(chǎn)物，然后被水解[55]。還有報(bào)道稱linB能夠降解linA不能降解的β-六六六[58]。六六六降解上游途徑中，最后產(chǎn)生的酶是一種NAD+依賴的脫氫酶，該酶由linC基因編碼[38]。六六六降解終產(chǎn)物為2，5-二氯對(duì)苯二酚[55]。Liang等[59]分離得到百菌清高效降解菌Pseudomonassp.CTN-3，構(gòu)建基因文庫后克隆得到水解脫氯酶chd基因，該基因直接負(fù)責(zé)降解百菌清，通過核磁共振波譜鑒定水解脫氯產(chǎn)物為4-Cl被-OH取代形成CTN-OH。此外，還有在有機(jī)氯農(nóng)藥降解下游途徑中出現(xiàn)的還原酶，其典型代表就是氨基酸序列和θ-谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)相似的linD，它能夠?qū)?，5-二氯對(duì)苯二酚經(jīng)氯代對(duì)苯二醛還原為對(duì)苯二醛[60]；還有間裂解雙加氧酶linE，它能裂解含有兩個(gè)-OH的苯環(huán)中間位-OH，linE也具有環(huán)裂解雙加氧酶活力，能裂解對(duì)苯二醛、氯代對(duì)苯二醛、2，6-二氯對(duì)苯二酚[61]。氯代對(duì)苯二醛則能被馬來酰醋酸還原酶linF還原為馬來酰醋酸[39]。

表2列出了微生物降解有機(jī)氯農(nóng)藥的相關(guān)基因和酶。

表2 微生物降解有機(jī)氯農(nóng)藥的相關(guān)基因和酶Tab.2 Related genes and enzymes for microbial degradation of organochlorine pesticides

4 展望

2002年，世界衛(wèi)生組織宣布，重新啟用滴滴涕用于控制蚊子的繁殖以及預(yù)防登革熱等疾病，因此，有機(jī)氯農(nóng)藥對(duì)環(huán)境造成的污染和危害仍在繼續(xù)，生物修復(fù)有機(jī)氯農(nóng)藥污染環(huán)境的應(yīng)用技術(shù)仍然需要不斷深入研究。目前的研究表明，單一微生物菌株降解有機(jī)氯農(nóng)藥時(shí)間長、見效慢，且作用環(huán)境要求苛刻；而聯(lián)合培養(yǎng)菌株，構(gòu)建高效降解優(yōu)勢菌群制成菌劑，對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥污染環(huán)境進(jìn)行修復(fù)，雖快速高效，但要徹底解決有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留污染問題，還需要進(jìn)一步探究微生物菌群之間的作用機(jī)理以及影響微生物降解有機(jī)氯農(nóng)藥的環(huán)境因素，以優(yōu)化生物修復(fù)技術(shù)。同時(shí)，需要加強(qiáng)研究lin基因的多樣性、分子遺傳學(xué)及潛在的降解能力，通過基因工程手段構(gòu)建適合于規(guī)?；到庥袡C(jī)氯農(nóng)藥應(yīng)用的高效工程菌，并應(yīng)用于有機(jī)氯農(nóng)藥污染環(huán)境的生物修復(fù)。