HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地、不同干燥法葛根中主要異黃酮類成分的含量

朱智蕓，趙 毅，車彥云，王自梁

(1.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明，650000；2.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明, 650500；3.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛.味甘、辛、涼，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽(yáng)止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒等功效[1].葛根的主要成分是異黃酮類化合物，包含葛根素、大豆苷、大豆苷元、三萜類和芳香類等成分[2-3]，其中主要活性成分葛根素、大豆苷和大豆苷元[4-6]，具有改善心腦血管循環(huán)、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗心肌缺血、減慢心率、降低心肌耗氧量、抗脂質(zhì)過(guò)氧化和消除自由基、降血糖降血脂、防止骨質(zhì)疏松、保護(hù)腦缺血及缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷等作用[7-14].在中國(guó)，葛根資源豐富，除西藏、新疆等地外，其它地區(qū)均有分布，但不同的生長(zhǎng)環(huán)境葛根成分含量不同[16].云南產(chǎn)葛根中異黃酮類成分的含量的測(cè)定雖有相關(guān)報(bào)道，但樣品產(chǎn)地單一，并沒(méi)有進(jìn)行多個(gè)產(chǎn)地系統(tǒng)的比較，尚不能很好的說(shuō)明問(wèn)題.本實(shí)驗(yàn)所用葛根樣品分別為云南曲靖品種、建水品種、牟定品種、牟定種植的廣西品種和牟定種植的曲靖品種，并與陜西、山西、廣西產(chǎn)的葛根做對(duì)比，更能說(shuō)明云南不同產(chǎn)地葛根中主要有效成分含量的情況.干燥處理有利于葛根的貯存，目前最常用的干燥方法是烘干和自然風(fēng)干，但不同干燥方法對(duì)葛根中異黃酮類化合物的含量影響不同[15].本實(shí)驗(yàn)建立一種同時(shí)測(cè)定葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的方法，并用這種方法測(cè)定不同產(chǎn)地、不同干燥方法葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量，為云南葛根藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)建立、生長(zhǎng)條件研究、種植、貯存及開(kāi)發(fā)利用提供有效依據(jù).

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

1.2 儀器

Agilent 1260 HPLC(美國(guó)安捷倫公司)；超純水制備儀(深圳宏森環(huán)保有限公司)；恒溫真空干燥箱D27-6020(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器KQ-700TDV(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平ML204/02(上海梅特勒托利多儀器公司).

1.3 試劑

葛根素、大豆苷、大豆苷元對(duì)照品均購(gòu)買于中國(guó)食品藥品檢定研究院.甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以甲醇-水溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫(見(jiàn)表1)，流速 0.7 mL/min，柱溫 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 250 nm.

表1 梯度洗脫條件

2.2 葛根粉的制備

將8個(gè)產(chǎn)地的葛根洗凈，去除表面泥沙，切成小塊，8個(gè)產(chǎn)地的葛根一部分于 50 ℃ 烘干、一部分自然風(fēng)干，粉碎，過(guò) 0.301 mm 篩后保存?zhèn)溆?

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取葛根素 4 mg，大豆苷 0.53 mg 及大豆苷元 0.27 mg，置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，然后吸取 5.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，定容，作為對(duì)照品溶液.

2.4 供試溶液的制備

分別精密稱取葛根粉末各 0.20 g，加入50%乙醇 20.0 mL，超聲提取 40 min，過(guò)濾，用50%乙醇洗滌，將濾液蒸干，再用50%乙醇溶解并定容至 5 mL 容量瓶中.經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后作為液相色譜供試溶液.

2.5 方法學(xué)考查

2.5.1 線性關(guān)系

教師的教學(xué)方式單一是影響教學(xué)質(zhì)量和教學(xué)效果的重要原因。很多教師在教學(xué)過(guò)程中往往采用“灌輸式”的教學(xué)方式，只注重教師講課的連貫性，忽視了與學(xué)生之間的交流和溝通，導(dǎo)致課堂教學(xué)氣氛沉悶。此外，這種方式也忽視了實(shí)踐性教學(xué)的重要性，沒(méi)有將道德與法治課堂知識(shí)與生活結(jié)合，學(xué)生在理解時(shí)不夠深入[1]。

取2.3項(xiàng)下對(duì)照品母液，分別精密吸取0.5、1.5、3.0、4.5、6.0和 7.5 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋制刻度.取 10 μL 進(jìn)樣，按色譜條件測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算回歸方程.

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液 10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定，以峰面積積分值分別計(jì)算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品混合液 10 μL，分別在0, 1, 4, 6,10 h 時(shí)進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，平行配制5份供試品溶液，進(jìn)樣 10 μL.分別計(jì)算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取葛根粉末 0.1 g，共4份，其中3份各加 0.410 mg 葛根素、0.256 mg 大豆苷及 0.048 mg 大豆苷元，另1份不加對(duì)照品，按供試溶液的制備法提取，定容.按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及其RSD值.

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的種類、pH值、流速以及柱溫等因素可影響目標(biāo)化合物的分離效果和保留時(shí)間.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一系列篩選確定了適宜的色譜條件：甲醇-水作為流動(dòng)相，流速 0.7 mL/min，柱溫 30 ℃，該色譜條件下，目標(biāo)化合物峰達(dá)到良好的基線分離，峰型良好.異黃酮類化合物具有苯甲酰結(jié)構(gòu)，在紫外 250 nm 左右有最強(qiáng)吸收，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為 250 nm.

3.2 方法學(xué)考查結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系

葛根素:Y=896.74x-35.468，r2=0.999 8，線性范圍20～300 mg/L.大豆苷:Y=182.54x-12.173，r2=0.999 7，線性范圍2.65～39.75 mg/L.大豆苷元:Y=81.019x-2.554 1，r2=0.999 6，線性范圍1.35～20.25 mg/L.結(jié)果表明，此方法在一定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

3.2.2 精密度試驗(yàn)

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分別為0.28%，0.57%，0.46%，表明此方法精密度良好.

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分別為1.79%，0.95%，0.92%，表明 10 h 內(nèi)葛根素、大豆苷及大豆苷元穩(wěn)定性良好.

3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分別為0.47%，0.65%，0.88%(n=5)，表明此方法重復(fù)性良好.

3.2.5 回收率試驗(yàn)

葛根素、大豆苷和大豆苷元的平均加樣回收率分別為109.1%、99.0%和106.3%，RSD值分別為0.99%，1.80%，1.93%.詳見(jiàn)表2.

表2 葛根樣品回收率測(cè)定結(jié)果

3.3 樣品的測(cè)定

精密吸取 10 μL 供試溶液進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰峰面積積分值，計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.葛根素、大豆苷及大豆苷元對(duì)照品的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1，葛根樣品的HPLC色譜圖見(jiàn)圖2.

表3 8個(gè)不同產(chǎn)地葛根樣品中葛根素、大豆苷及大豆苷元含量的測(cè)定結(jié)果 (mg·g-1)

圖1 葛根素、大豆苷、大豆苷元對(duì)照品HPLC圖譜 圖2 葛根樣品HPLC圖譜

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，樣品各物質(zhì)峰達(dá)到良好的基線分離，峰型良好.經(jīng)方法學(xué)考察，表明該方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和快速的優(yōu)點(diǎn)，可以用于葛根藥材中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量測(cè)定，為葛根藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ).

不同產(chǎn)地葛根藥材中葛根素、大豆苷和大豆苷元3種成分總含量比較：陜西﹥?cè)颇夏捕ī冊(cè)颇夏捕ǚN植的曲靖品種﹥?cè)颇夏捕ǚN植的廣西品種﹥?cè)颇辖ㄋa(chǎn)的葛根﹥?cè)颇锨俯兘鳗儚V西，這表明環(huán)境差異對(duì)葛根的生長(zhǎng)有較大影響.同一產(chǎn)地、不同干燥方法制得的葛根藥材中葛根素、大豆苷和大豆苷元3種成分總含量比較：烘干﹥自然風(fēng)干，這可能與干燥過(guò)程中的空氣溫度、流速和濕度等因素有關(guān)，有待后續(xù)研究驗(yàn)證.本文研究結(jié)果可為云南優(yōu)良葛根資源的采集、栽培和利用提供技術(shù)支撐.