象草全基因組bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定及表達分析

高莉娟，張正社，文裕，宗西方，閆啟，盧麗燕，易顯鳳，張吉宇*

（1. 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；2. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，廣西 南寧 530007；3. 廣西畜牧研究所，廣西 南寧 530001）

象草（Cenchrus purpureus）為禾本科蒺藜草屬多年生的C4草本植物，起源于非洲，目前在全世界熱帶和亞熱帶地區(qū)均有栽培種植［1-2］。20 世紀40 年代由印度、緬甸等低緯度地區(qū)引入我國［3］?，F(xiàn)已在江西、福建、湖南、臺灣等地區(qū)廣泛栽培種植［4-5］。象草莖葉中粗蛋白含量可達10.8%，營養(yǎng)價值高，生物量大，抗逆性強，再生能力強，已成為世界上公認的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草［6-9］。近年來，隨著生活水平的提高，人們愈加重視食物種類和安全問題，在肉類的選擇上更傾向于草食動物產(chǎn)品，因此，進一步提高牧草產(chǎn)量顯得至關重要［10］。

bHLH（basic-helix-loop-helix）類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，該類蛋白因具有bHLH 結構域而得名［11-12］。該結構域大約由60 個氨基酸殘基構成，按照其功能可分為堿性區(qū)域和HLH 區(qū)域［13］。堿性區(qū)域由15～20 個氨基酸組成，分布在多肽鏈N 端，含有大量堿性氨基酸，能與DNA 結合，其保守氨基酸可識別E-box（5＇-CANNTG-3＇）［14］。HLH 區(qū)域大約由40 個氨基酸組成，分布在C 端，依賴疏水氨基酸的互作可以促使蛋白質(zhì)形成同源或異源二聚體［15-16］，這些二聚體可以與靶基因啟動子的不同部分相結合，在真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著十分重要的作用［17-19］。

bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在植物形態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。據(jù)報道，水稻（Oryza sativa）的稀穗突變體（LAX PANICLE，LAX）是屬于bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，是控制植株頂端分生組織的主要調(diào)節(jié)因子［20］。研究表明，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在花色素生物合成過程中起著重要的調(diào)控作用。在水稻中，OSB1 和OSB2 能夠參與調(diào)控花青素的生物合成［21］。隨后在矮牽牛（Petunia hybrida）中獲得的AN1基因被證明可以參與花青素的合成［22］。bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子參與植物對逆境響應的研究備受關注，該家族通過激活相關基因的表達，進而提高了植物對干旱、低溫、缺素等惡劣環(huán)境的耐受性［23］。SPATULA基因首次在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中被發(fā)現(xiàn)，是一個多功能基因，主要調(diào)節(jié)擬南芥花形態(tài)建成和角果發(fā)育等多種發(fā)育過程的bHLH 蛋白。此外，SPATULA也參與控制莖尖分生組織的周圍區(qū)以及葉片、花瓣、柱頭和根的特定組織的發(fā)育［24-25］。隨著分子生物學的快速發(fā)展，bHLH家族的多樣性已被揭示，且植物bHLH 轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在擬南芥［26］、水稻［27］、楊樹（Populussp.）［28］、玉米（Zea mays）［14］以及其他物種中得到鑒定，但象草bHLH家族成員分析還未見報道。

本研究通過全基因組數(shù)據(jù)庫搜索鑒定，共鑒定出229 個CpbHLH基因，并對其進行了系統(tǒng)發(fā)育、染色體分布、保守基序生物信息學分析，并結合本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序（未發(fā)表數(shù)據(jù)），分析了CpbHLHs基因在赤霉素（gibberellin，GA3）和多效唑（paclobutrazol，PAC）處理之后的表達情況。這將為深入研究象草CpbHLH基因家族生物學功能提供科學依據(jù)，并有助于bHLH基因在其他植物物種中的功能研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試象草的種莖由廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所提供，于2019 年5 月在蘭州大學榆中校區(qū)溫室內(nèi)種植，在種植后的30 d（節(jié)間發(fā)生最早期）［29］，各選取27 株長勢較為一致的象草，以噴霧的方式分別均勻噴施200 mg·L-1的赤霉素（GA3）和500 mg·L-1的多效唑（PAC），噴施蒸餾水作為對照（CK），處理時間為8：00 am，在整個噴施過程中，將相鄰的植株用黑色塑料袋罩起來。在處理后的0，1，48 h 分別取各處理的莖尖，每個時間點至少取9 個單株，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 象草bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

從PlnTFDB（3.0）（http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/）下載得到水稻和擬南芥bHLH 蛋白序列。象草全基因組數(shù)據(jù)來自本課題組［30］，編碼序列（coding sequence，CDS）、蛋白質(zhì)序列、基因序列均下載自國家生物信息中心（National Genomics Data Center，https://bigd.big.ac.cn/）。以水稻和擬南芥bHLH序列作為查詢序列，利用BLAST 鑒定出象草基因組中的候選bHLH基因。然后，從PFAM 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載bHLH（PF00010）家族基因的隱馬爾科夫模型（hidden markov model，HMM），最后利用Pfam，NCBI conserved Domains（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫核對以確定bHLH 結構域（PF00010）的存在。

1.3 染色體定位分析

提取所有bHLH基因在象草基因組中的位置信息，利用在線工具MapGene2Choromosomev2（http:/mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制CpbHLH家族基因的染色體定位圖譜。

1.4 系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 7 軟件，使用鄰接法（neighbor-joining，NJ）對象草和水稻的蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹的構建，其中校驗參數(shù)Bootstrap=1000，其他參數(shù)均使用系統(tǒng)默認值。

1.5 基因結構、保守基序分析

利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme；最佳匹配長度為6～50，最大基序數(shù)為10）在線工具對提取到的bHLH 蛋白序列進行保守基序（motif）分析。使用基因結構顯示系統(tǒng)GSDS（http://gsds.cbi.pku. edu.cn/index.php）繪制基因結構示意圖。

1.6 象草bHLH 基因在赤霉素和多效唑處理后的表達分析

采用Trizol 試劑（北京天根生化科技有限公司）提取象草莖尖分生組織的總RNA，質(zhì)量檢測合格后，用于象草cDNA 文庫的構建和Illumina 上機測序，該過程均由北京諾禾致源科技股份有限公司（http:// www.novogene.com/）完成。測序完成之后，利用獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表）中bHLH基因在GA3和PAC 處理之后的莖尖分生組織的表達量（fragments per kilobase million，F(xiàn)PKM），繪制熱圖。

采用qRT-PCR 分析CpbHLH家族9 個基因在象草經(jīng)GA3和PAC 處理之后的表達模式。引物序列見表1，選用象草CpEE1a為內(nèi)參基因［31］，PCR 反應程序為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。每組試驗設3 個生物學重復，應用2-ΔΔCT方法計算各基因的相對表達量［32］。

表1 實時定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequences used in real-time quantitative PCR

1.7 象草bHLH 基因的功能分析

為了進一步明確CpbHLHs基因的功能及屬性，本研究利用百邁客云在線數(shù)據(jù)分析平臺（www.biocloud.net）對鑒定得到的229 個CpbHLHs基因進行GO 分類注釋。

2 結果與分析

2.1 CpbHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定及其染色體定位分析

在象草基因組中總共鑒定得到229 個bHLH基因，根據(jù)它們在染色體上的位置分布，依次命名為CpbHLH001～CpbHLH229。

CpbHLH基因染色體定位（圖1）分析表明，229 個CpbHLH基因分布在象草基因組上的14 條染色體上，其中B01 號染色體上分布最多，有23 個基因，占總的CpbHLH基因的10.0%。其次為B03 號和A07 號，分別占總個數(shù)的9.2%（21）、8.7%（20）。B07 號染色體上分布的基因最少，只有5 個基因，占總個數(shù)的2.2%。在象草A03 號、A04 號、A05 號、B06 號染色體的 底端，以及A02 號、A06 號、B04 號、B05 號 染色體頂端 發(fā)現(xiàn)了CpbHLH基因的基因簇。

圖1 象草CpbHLH 基因在染色體上的定位Fig.1 Chromosomal locations of C. purpureus bHLH gene family

2.2 CpbHLH 基因家族基因結構及保守基序分析

通過對CpbHLH 蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，可以分為11 個亞族（圖2a）。比較每個CpbHLH基因的內(nèi)含子/外顯子結構，對其結構進行分析（圖2b）顯示，CpbHLH基因中外顯子數(shù)目為1（CpbHLH046，CpbHLH003等）～12（CpbHLH051）個不等，大多數(shù)基因（90%）含有1～6 個外顯子，長度在300 kb 以上。內(nèi)含子的數(shù)目差異較大，數(shù)目最多的是CpbHLH129和CpbHLH018，為11 個，有11 個CpbHLH基因不存在內(nèi)含子。

圖2 象草CpbHLH 轉(zhuǎn)錄因子的保守基序分析Fig.2 The conserved motifs analysis of C. purpureus bHLH transcription factors

為了進一步揭示CpbHLH 蛋白在象草中的功能多樣性，使用MEME 軟件進行蛋白結構域預分析。結果分析表明：CpbHLH 蛋白結構較為保守，總共鑒定得到10 個比較保守的Motif（Motif1～10），其中Motif1 和Motif2 最為保守，是各組共有基序（圖2c）。除共有基序外，各組基序還具有一定特異性，如Motif6 僅在Ⅵ亞組中存在，Motif9 只在I 和Ⅵ亞組中存在。

2.3 CpbHLH 基因家族系統(tǒng)進化分析

利用象草中229 條和水稻中的167 條bHLH 蛋白序列，進行象草和水稻中的系統(tǒng)進化關系分析。結果表明（圖3），與水稻的22 個亞家族相比較，象草的229 個CpbHLHs成員分布在18 個亞家族中，其中兩個物種都是C 亞類的成員數(shù)量最多。其次為B 亞族，含有24 個CpbHLH基因。G 亞族中CpbHLH成員數(shù)量較少，僅為2 個。其中Q、H、K、F 亞族中不包含CpbHLH基因。

圖3 象草與水稻bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of bHLH transcription factors in C. purpureus and O. sativa

2.4 CpbHLH 基因家族的表達分析

通過前期用赤霉素與多效唑處理不同時間后，對象草莖尖的轉(zhuǎn)錄組測序，得到RNA-seq 數(shù)據(jù)，分析得到CpbHLH基因在不同處理下的表達量（圖4）。結果顯示，赤霉素與多效唑處理后的不同時間點，bHLH基因均顯示出高表達水平，因此可以推測在莖尖分生組織中表達的CpbHLH基因，其功能可能具有相似性。CpbHLH在GA3處理1 和48 h 以及PAC 處理1 和48 h 后分別有55、65 和51、56 個CpbHLH基因差異表達。

圖4 象草CpbHLH 基因在GA3和PAC 處理1 和48 h 之后的表達分析Fig.4 Expression analysis of bHLH gene in C. purpureus after GA3 and PAC treatments for 1 and 48 hour

本研究結合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取了9 個在莖尖分生組織中相對表達量較高的CpbHLHs，進行赤霉素和多效唑處理之后的表達分析（圖5）。研究結果顯示，CpbHLH019、CpbHLH025、CpbHLH030、CpbHLH158在GA3處理之后的表達模式相似，在處理48 h 之后的表達量均高于1 h，且高于對照。CpbHLH013、CpbHLH055赤霉素處理1 h 之 后 的 表 達 量 高 于48 h，但CpbHLH002、CpbHLH017、CpbHLH156在GA3處 理 之 后 均 低 于 對 照。CpbHLH002、CpbHLH013、CpbHLH019在PAC 處 理48 h 后 表 達 量 高 于 處 理1 h 且 高 于 對 照。CpbHLH017、CpbHLH025、CpbHLH055、CpbHLH156在PAC 處理1 h 后的表達量均高于處理48 h 和對照，僅CpbHLH158經(jīng)PAC 處理之后表達量低于對照。

圖5 CpbHLH 各成員在GA3和PAC 處理下的表達模式Fig.5 Expression pattern of CpbHLH genes under GA3 and PAC treatment

2.5 CpbHLH 基因家族的GO 分類結果分析

通過GO 功能對229 個CpbHLHs基因進行分類，發(fā)現(xiàn)可以將這些基因劃分成47 個功能組（圖6）。根據(jù)功能組的不同，又分為生物過程（biological process，20 個亞類），細胞組分（cellular component，15 個亞類）和分子功能（molecular function，13 個亞類）3 大類，分別占41.67%、31.25%、27.08%。在生物過程中，主要的亞類是“細胞過程”（cellular process），“代謝過程”（metabolic process）；在細胞組分中，“細胞”（cell），“細胞組分”（cell part）和“細胞器”（organelle）是主要的亞類；在分子功能類別中，“結合”（binding）和“核酸結合轉(zhuǎn)錄因子活性”（nucleic acid binding transcription factor activity）占比最多。

圖6 象草bHLH 基因的GO 分類Fig.6 GO classification of CpbHLH genes

3 討論

bHLH基因家族成員可以參與調(diào)控植物對逆境脅迫響應和信號轉(zhuǎn)導等，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用［33-34］。到目前為止，關于模式植物：擬南芥以及水稻等bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族相關研究已經(jīng)較為成熟，象草作為一種優(yōu)質(zhì)牧草，其推廣種植具有重要意義，而其關于bHLH家族的研究卻未有相關報道［35］。

本研究在象草基因組中總共鑒定得到229 個bHLH基因。根據(jù)染色體定位分析，大多數(shù)CpbHLHs基因被定位到象草染色體的頂端和底端，該結果與二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中的研究結果相似［36］，說明CpbHLHs基因進行了一定程度的收縮與擴張，這些基因更容易在染色體的頂端或底端被圖位克?。?3］。

基因進化過程中結構變異起著重要作用，其中內(nèi)含子會隨著生物體內(nèi)基因組的進化而進化，而進化主要體現(xiàn)在其種類和含量上［37］。Xu 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子、外顯子會通過獲得與丟失，插入或刪除等方式來進化。本研究發(fā)現(xiàn)229 個CpbHLHs基因的外顯子個數(shù)為1～12，內(nèi)含子個數(shù)為0～11，說明CpbHLHs基因在進化過程中出現(xiàn)了外顯子、內(nèi)含子的插入或丟失，導致CpbHLHs基因中外顯子與內(nèi)含子的個數(shù)差異甚大，該現(xiàn)象在一定程度上影響CpbHLHs基因發(fā)揮其生物學功能。使用在線軟件MEME 對象草229 條bHLH基因的保守基序進行分析，發(fā)現(xiàn)CpbHLHs基因存在10 個具有高度保守性的氨基酸基序，且同一亞家族中的大多數(shù)保守基序相似。表明每個亞家族中編碼蛋白的功能是穩(wěn)定的，幾乎所有的CpbHLHs 蛋白均包含Motif1 和Motif2，且總是相鄰，共同構成bHLH 結構域，所有這些bHLH 保守基序在同一亞家族的獨特性及保守性也是對CpbHLHs基因家族的進化分類的佐證。同時推測，除bHLH 結構域外的其他保守基序也是每個亞家族發(fā)揮其相應功能的關鍵。總之，對bHLH的基因結構以及保守基序的分析，為bHLH基因的進化與分類提供了參考依據(jù)。它們在bHLH 中數(shù)量的變化也從側(cè)面反映出bHLH 蛋白功能的分化，進一步證明bHLH 蛋白在植物生長發(fā)育的各個階段所表現(xiàn)出的功能多樣性。

系統(tǒng)進化樹分析結果表明，CpbHLHs可以劃分為18 個亞家族。與已報道的水稻、擬南芥及蘋果（Malus pumila）［39］中的bHLH基因家族的結果比較，象草中發(fā)現(xiàn)的bHLH基因數(shù)量多于其他已報道的植物，這種情況可能與象草的四倍體進化事件有關［2，30］。在植物中，Pires 等［40］對源自藻類和陸生植物的500 多個bHLH 蛋白序列進行分析，將其分為26 個亞家族；白菜（Brassica campestris）中的203 個bHLH 蛋白可被劃分為24 個亞家族［41］；番茄（Solanum lycopersicum）中的152 個bHLH 蛋白可以劃分為24 個亞家族［42］。與水稻相比，CpbHLHs家族成員并沒有分布在所有亞類中，有4 個亞類中沒有CpbHLH家族的成員，推測這可能是象草在進化的過程中發(fā)生了基因的丟失。此外，CpbHLH家族在G 亞類中的成員數(shù)量最少，僅為2 個，說明該亞類內(nèi)的成員進化速度相對緩慢，推測這些基因在功能上相對比較保守，可能對象草的生長發(fā)育有著重要的調(diào)控作用［43］。象草在C 亞類中的bHLH成員數(shù)量最多，這與水稻、擬南芥［27］的聚類結果相似，該亞類轉(zhuǎn)錄因子的功能主要被預測為逆境響應和參與依賴脫落酸（abscisic acid，ABA）的信號傳導［44］。本研究中，赤霉素處理后最大表達量基因CpbHLH055與多效唑處理1 h 后最大表達量基因CpbHLH076都為C 亞類，qRT-PCR 分析9 個隨機挑選的CpbHLH基因在赤霉素與多效唑不同處理時間后的莖尖分生組織中的差異表達，這為bHLH 蛋白參與到赤霉素和多效唑誘導的生物學途徑提供了證據(jù)。且其中CpbHLH017、CpbHLH025、CpbHLH030、CpbHLH055、CpbHLH156均為C 亞類。徐秀榮等［43］對 毛 竹（Phyllostachys edulis）bHLH 家 族 成 員 的C 亞 類 的4 個 基 因pebHLH072、pebHLH102、pebHLH112和pebHLH123在干旱和鹽脅迫過程中的表達變化的研究結果支持了這一推測。說明該亞類內(nèi)的成員可能對象草的生長發(fā)育有著非常重要的調(diào)控作用。

研究表明，水稻bHLH家族基因OsbHLH013、OsbHLH016、OsbHLH165參與調(diào)控花青素的合成；OsbHLH35可被干旱和鹽脅迫誘導而上調(diào)表達，它可在水稻種子萌發(fā)階段改變ABA 代謝基因的表達，降低ABA水平，提高種子的發(fā)芽率；基因OsbHLH001受冷脅迫誘導而上調(diào)表達，但不被ABA 或NaCl 所誘導；OsbHLH096參 與 缺 磷 脅 迫 反 應［45-47］。系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 析 顯 示（圖3），CpbHLH家 族 基 因CpbHLH016、CpbHLH227與OsbHLH013、OsbHLH016、OsbHLH165聚集在一起，歸屬于U 亞族；CpbHLH139與OsbHLH35聚集在一起，歸屬于V 亞組，CpbHLH100與OsbHLH001聚集在一起，歸屬于R 亞族；CpbHLH193、CpbHLH045、CpbHLH044與OsbHLH096聚在一起，歸屬于C 亞族；通過同源基因功能相似性方法，預測到這些CpbHLH家族基因與水稻同源性基因具有相似功能。通過GO 分類發(fā)現(xiàn)，與分子功能和細胞組分相比，生物學過程的GO 分類數(shù)較多，共有20 個分類。說明CpbHLH 轉(zhuǎn)錄因子在參與多個生物學過程調(diào)控中發(fā)揮較為重要的作用，表明CpbHLH家族具有功能多樣性，這些結果可為將來CpbHLH基因功能的進一步分析提供依據(jù)。

4 結論

本研究對CpbHLH基因家族進行分析，共鑒定篩選出229 個CpbHLH基因家族成員，并對其進行了生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)各基因?qū)Τ嗝顾?、多效唑處理之后的響應也不同。因此，bHLH基因在象草體內(nèi)的調(diào)控機理還需要驗證，進一步為象草的生長發(fā)育提供重要的信息。