環(huán)氧化酶2和金屬基質(zhì)蛋白酶9在胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

余 松，侯能易，嚴(yán) 力，王 康，潘 燕，趙應(yīng)濤，王 越，曹欽興，謝 偉，旦真甲，龐明輝,,c

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000； 2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.胃腸外科，b.消化內(nèi)科，c.老年綜合外科，四川 成都 610072；3.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611731)

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasms，NENs)可出現(xiàn)在機(jī)體多個(gè)部位，其發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)[1]。大多數(shù)腫瘤生長(zhǎng)緩慢，多發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)不典型，常常于體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)。因其具有較高的惡性潛能，在初次診斷時(shí)約有25%發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的中位生存期約為2～5年[3]。因此，探索早期診斷指標(biāo)、預(yù)后指標(biāo)仍然是NENs防治不可忽視的環(huán)節(jié)。環(huán)氧化酶2(cycloxygenase-2，COX-2)是一種誘導(dǎo)性蛋白酶，在多種實(shí)體性腫瘤中檢測(cè)到COX-2及其代謝產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)的表達(dá)量升高[4]，提示其在腫瘤形成過(guò)程中有著一定的促進(jìn)作用[5～7]，并在腫瘤周圍微環(huán)境中具有炎癥調(diào)節(jié)的作用。MMP-9可參與細(xì)胞基底膜的修復(fù)與重建、組織修復(fù)等，與多種蛋白一起完成許多重要的生物合成過(guò)程。在胰腺癌、肺癌、肝癌等惡性程度高的腫瘤中檢測(cè)到MMP-9的表達(dá)量升高[8～10]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤負(fù)荷、分期評(píng)估以及預(yù)后預(yù)測(cè)的評(píng)估具有指導(dǎo)作用。COX-2、MMP-9與胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastrointestinal neuroendocrine neoplasms，GI-NENs)發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。本研究采用免疫組化的方法檢測(cè)175例GI-NENs患者中COX-2、MMP-9的表達(dá)情況，分析其臨床病理資料及生存數(shù)據(jù)，探討COX-2、MMP-9在GI-NENs診治中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2016年11月至2020年8月經(jīng)四川省人民醫(yī)院診治的175例GI-NENs患者的臨床病理資料。所有患者均經(jīng)內(nèi)鏡或者手術(shù)病理診斷為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，未行術(shù)前放化療等；病理組織均來(lái)自本院病理科的石蠟切片。根據(jù)病理的增殖程度及分化程度，分為NET G1 110例、NET G2 25例、NET G3 3例、NEC 21例和MiNEN 16例。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)消化系統(tǒng)腫瘤分類[11]。

1.2 方法石蠟包埋的腫瘤組織切片，經(jīng)脫蠟，酒精梯度水化處理，檸檬酸鹽緩沖液(0.01M pH 6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)處理，山羊血清封閉，一抗孵育(COX2兔抗人單克隆抗體，1∶100(濃度)，ZA-0515)，4 ℃過(guò)夜，添加二抗(山羊抗兔工作液，SP-9001)，37 ℃ 30 min，DAB顯色試劑顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.3 免疫組織化結(jié)果判讀經(jīng)免疫組化處理好的切片先在100倍的顯微鏡下觀察總體染色情況，然后在400倍顯微圖像下采集3個(gè)視野。圖像采集后，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)算每個(gè)視野下的光密度(integrated optical density，IOD)和面積，再測(cè)算每個(gè)視野下的平均光密度(Mean density，MD)，再得出3個(gè)視野下圖像的MD的平均值，由此得出每例樣本中COX-2、MMP-9的平均的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪患者的聯(lián)系方式通過(guò)病案首頁(yè)、住院患者隨訪群等方式查詢到，通過(guò)電話、微信、門診隨訪等方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截至2021年6月。從疾病初次確診時(shí)間至當(dāng)前隨訪或患者死亡的時(shí)間定義為總生存時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。Kaplan-Meier生存曲線、Cox回歸進(jìn)行生存分析；組間生存分析比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤切片中MMP、COX-2的表達(dá)情況COX-2(圖1a～e)、MMP-9(圖2a～d)主要在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)表達(dá)，染色黃色或棕黃色細(xì)胞代表陽(yáng)性，染色藍(lán)色細(xì)胞代表陰性，底物呈現(xiàn)白色。

圖1 COX-2在GI-NENs中的表達(dá)情況 (免疫組化染色×400)a:NET-G1 b:NET-G2 c:NET-G3 d:NEC e:MiNEN

圖2 MMP-9在GI-NENs中的表達(dá)情況 (免疫組化染色×400) a:NET-G1 b:NET-G2 c:NEC d:MiNEN

2.2 不同臨床病理特征GI-NENs患者COX-2的表達(dá)比較不同腫瘤位置、腫瘤最大直徑、TNM分期、病理分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移的患者COX-2表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；性別、年齡與其COX-2的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征GI-NENs患者COX-2的表達(dá)比較

2.3 不同臨床病理特征GI-NENs患者M(jìn)MP-9的表達(dá)比較60例GI-NENs患者M(jìn)MP-9的表達(dá)在性別、年齡、腫瘤直徑大小、位置、TNM分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理特征GI-NENs患者M(jìn)MP-9的表達(dá)比較

2.4 COX-2表達(dá)情況與GI-NENs患者生存的關(guān)系

175例GI-NENs患者的隨訪時(shí)間為1～53個(gè)月，中位隨訪時(shí)間21月。其中GI-NETs、NEC和MiNEN的中位生存時(shí)間分別是23、9和18月。利用Kaplan-Meier行單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與生存預(yù)后較差相關(guān)(P<0.001)(圖3 a～d)。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析，提示病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者生存預(yù)后差的因素(見(jiàn)表3)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示高表達(dá)COX-2患者生存情況明顯較低表達(dá)患者差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3e)。

圖3 175例 GI-NENs患者的生存分析 a:病理分級(jí); b:TNM分期; c:有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移; d:有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移； e：不同COX-2表達(dá)情況下的生存分析

表3 GI-NENs患者總生存率的COX多因素分析

3 討論

NENs生長(zhǎng)緩慢，但生物學(xué)行為不一，約有1/4在初次診斷發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶多位于肝臟[12]。大部分GI-NETs的發(fā)現(xiàn)主要依靠胃腸鏡篩查，并且預(yù)后較好；然而，NEC和MiNEN其惡性程度較高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，總體預(yù)后較NET差。近年來(lái)隨著臨床醫(yī)師的重視，更多的患者被發(fā)現(xiàn)，但其侵襲機(jī)制以及預(yù)后因素的研究較少，尋找有效的治療靶點(diǎn)以及精準(zhǔn)的預(yù)后預(yù)測(cè)因素，對(duì)GI-NENs的診療有著重要的意義。

MMP-9是一種金屬基質(zhì)蛋白酶。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中MMP-9的表達(dá)量上調(diào)，與腫瘤的分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示可能參與腫瘤的侵襲、經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移過(guò)程[13]。同樣在胰腺癌、肺癌以及肝癌組織中也檢測(cè)到MMP-9的高表達(dá)[8～10]。本研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-9在GI-NENs的表達(dá)，與腫瘤病理分級(jí)、腫瘤部位、TNM分期、遠(yuǎn)處以及淋巴轉(zhuǎn)移等因素均無(wú)相關(guān)性。這與大部分MMP-9與腫瘤的關(guān)系研究中有一定差異，分析原因可能是NENs高度的異質(zhì)性是主要原因，其次樣本量不足，NET病理分級(jí)中缺少NET-G3的患者，樣本不具有代表性，可能也是其中原因之一。

COX-2是機(jī)體合成前列腺素過(guò)程中的誘導(dǎo)性限速酶[14]，基因位于1號(hào)染色體q25.2～25.3，正常生理狀態(tài)下的組織中很少表達(dá)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、大腸癌、胰腺癌以及乳腺癌等腫瘤組織中檢測(cè)到COX-2表達(dá)量增加[5，7，16]。深入研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可通過(guò)影響生長(zhǎng)周期、促進(jìn)血管生長(zhǎng)、破壞免疫細(xì)胞等機(jī)制，直接或間接地促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)在腫瘤組織的基因檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)COX-2是腫瘤肝臟轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移以及腦轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵轉(zhuǎn)移進(jìn)展基因之一[17]。本研究檢測(cè)到GI-NENs不同病理分級(jí)中COX-2表達(dá)有差異，在GI-NETs中，分級(jí)越高，表達(dá)量也升高，可能提示與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)系。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)COX-2在腫瘤分期晚、淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)高，生存分析提示高表達(dá)COX-2的患者其生存差。

在受到細(xì)胞內(nèi)外多種因素影響下，如細(xì)胞因子、癌基因、內(nèi)皮素等，COX-2可選擇性表達(dá)上調(diào)。在生成前列腺素E-2(PGE-2)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基、活性氧，這些物質(zhì)通過(guò)過(guò)氧化反應(yīng)催化前致癌物質(zhì)生成多環(huán)芳烴類以及黃曲霉等多種致癌物質(zhì)，直接致使遺傳信息的損害，造成細(xì)胞抑癌作用失調(diào)，這可能是COX-2促進(jìn)腫瘤發(fā)生的一種機(jī)制。在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑可使COX-2表達(dá)上調(diào)的癌細(xì)胞侵襲性顯著降低，提示COX-2表達(dá)的上調(diào)可降低鈣粘蛋白活性從而降低細(xì)胞間粘附反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力得到加強(qiáng)，有利于腫瘤細(xì)胞穿過(guò)胞外基質(zhì)，更有機(jī)會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的GI-NENs中，COX-2表達(dá)量高于陰性組，可見(jiàn)在GI-NENs的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮一定作用，但其具體參與腫瘤轉(zhuǎn)移途徑中的機(jī)制有待后續(xù)研究。此外，COX-2還能通過(guò)激活HER-2酪氨酸激酶受體，促進(jìn)腫瘤組織中高表達(dá)VEGF，參與腫瘤組織中血管的生長(zhǎng)以及腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等過(guò)程[18]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，COX-2在TNM分期較晚腫瘤中高表達(dá)，提示其參與了GI-NENs的發(fā)展侵襲。PGE2同樣也參與了腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。PGE2可促進(jìn)腫瘤血管的生成，同時(shí)抑制機(jī)體的免疫功能，在評(píng)估腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面有積極的作用[19]。COX-2在NENs中的研究相對(duì)較少，檢測(cè)方法以及樣本量都是影響研究的因素，還有更多的功能和調(diào)控機(jī)制待明確。

大量研究證實(shí)，COX-2抑制劑可使肺、乳房、結(jié)腸和前列腺等器官癌癥風(fēng)險(xiǎn)降低約68%，同時(shí)非甾體類抗炎藥還可提高腫瘤對(duì)放療以及化療的敏感性，可能為癌癥的預(yù)防及治療提供幫助[20]。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，C0X-2抑制劑一方面通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)，從而降低了PGE-2對(duì)促凋亡因子PPARγ的抑制作用[21]，另一方面還可通過(guò)刺激COX-2表達(dá)，誘導(dǎo)促凋亡因子PPARγ的表達(dá)[22]。COX-2可作為激素治療、MicroRNA治療的靶點(diǎn)以及作為放化療的輔助用藥，為腫瘤的防治提供了新的方向。

綜上所述，COX-2的表達(dá)與GI-NENs的病理分級(jí)、TNM分期相關(guān)，病理分級(jí)越高，分期越晚，其表達(dá)量越高，提示COX-2高表達(dá)可能與GI-NENs的發(fā)展侵襲有關(guān)系。GI-NENs的預(yù)后與病理分級(jí)、分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和COX-2高表達(dá)有關(guān)系，可預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況。本研究中NET-G3的患者較少，原因可能受既往免疫組化的影響以及本研究樣本量的不足。同時(shí)隨著NENs分級(jí)的進(jìn)一步細(xì)化，有必要將病理切片二次評(píng)估腫瘤的分級(jí)狀態(tài)。由于NEC、MiNEN的細(xì)胞來(lái)源以及驅(qū)動(dòng)基因和NETs存在明顯差異，COX-2在異質(zhì)性高的不同病理分級(jí)中的作用仍有待深入研究。