結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1、分離酶抑制蛋白在乳腺癌進(jìn)展中的作用

王 麗，郭宏艷，何利珍 ，張?jiān)砌?，?虹，聶登梅

(1.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)腫瘤發(fā)病率和死亡率的不斷上升，乳腺癌已取代肺癌，成為全球第一大癌，嚴(yán)重威脅著女性的健康，而且，關(guān)于進(jìn)展期乳腺癌的侵襲性和治療的研究一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)是一個(gè)與結(jié)腸癌密切相關(guān)的基因，也是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子[1]；分離酶抑制蛋白(Securin)通過(guò)抑制分離酶的活化，從而抑制染色體的過(guò)早分離，Securin的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞的非整倍性，進(jìn)而引起體內(nèi)基因轉(zhuǎn)化和體外腫瘤形成[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)MACC1和Securin在消化道癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[3，4]，發(fā)現(xiàn)MACC1和Securin與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，但是兩者在乳腺癌中的研究卻相對(duì)缺乏，本研究檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌不同病變組織中MACC1和Securin的表達(dá)情況，并探究二者在乳腺癌中的表達(dá)有無(wú)相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集甘肅省第二人民醫(yī)院病理科2015年1月至2020年6月乳腺活檢及乳腺癌根治手術(shù)標(biāo)本，均為女性患者，年齡25～78歲，中位47歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未接受化療、放療及其它輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前曾接受放化療或其他腫瘤的針對(duì)性治療者，并患有其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。其中乳腺導(dǎo)管普通增生(usual ductal hyperplasia，UDH)20例、導(dǎo)管異型增生(atypical ductal hyperplasia，ADH)20例、導(dǎo)管原位癌(ductal carcinama in situ，DCIS)15例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌26例、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌29例。其中20例UDH及20例ADH取自乳腺局部切除的標(biāo)本，乳腺癌病例取自根治標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及其它輔助治療。由兩位副主任以上病理醫(yī)師對(duì)病理進(jìn)行診斷、分類(lèi)和分級(jí)。液氮冷凍組織用于mRNA檢測(cè)，石蠟包埋組織用于免疫組化檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) Trizol法(Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)提取各液氮冷凍乳腺組織總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，按照cDNA第一鏈合成試劑盒(購(gòu)自加拿大Formentas公司)說(shuō)明書(shū)所述方法，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MACCl基因的上游引物序列為5′-GCTTGGGCTCACTTCCACAA-3′，下游引物序列為5′-ACCACGAAGGGTGAAAGCAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為201bp；Securin基因的上游引物序列為5′-GACTGTTCCGCTGTTTAGCTC-3′，下游引物序列為5′-GTGGGGCATCGAACGTTTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為295bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物序列為5′-CTGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物序列為5′-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為313 bp，以上引物均由生工生物(上海)工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.2免疫組織化學(xué) 手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，4～6 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化。浸入檸檬酸鹽修復(fù)液中熱抗原修復(fù)3 min，自然冷卻至室溫，放入PBS緩沖液中震蕩并沖洗3次，3 min/次。滴加3% H2O2孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次，3 min/次。滴加10%正常山羊血清，室溫孵育10 min，消除非特異性染色。滴加一抗(1∶200 MACC1兔抗人多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；Securin兔多克隆抗體(購(gòu)自Santa Crue(USA)公司))4 ℃過(guò)夜，次日PBS沖洗3次，3 min/次。滴加聚合物輔助劑，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，3 min/次。滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠IgG多聚體(試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，3 min/次。DAB顯色(試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司)，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。以PBS緩沖液置換一抗作為陰性對(duì)照，用已知MACC1陽(yáng)性的組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定MACC1蛋白產(chǎn)物主要表達(dá)于胞漿，少數(shù)可表達(dá)在細(xì)胞核，胞漿或胞核染色呈黃色或棕褐色者視為陽(yáng)性細(xì)胞； Securin蛋白產(chǎn)物主要表達(dá)于胞漿，胞漿染色呈黃色或棕褐色者視為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性范圍和陽(yáng)性強(qiáng)度綜合分析。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%記為0分，5%～30%記為1分；30%～60%記為2分；≥60%記為3分。無(wú)著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相加后分為4級(jí)：0～1分為陰性(-)；2分為弱陽(yáng)性(+)；3～4分為中度陽(yáng)性(++)；5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同乳腺組織中MACC1與Securin蛋白的表達(dá)情況MACC1蛋白主要表達(dá)于乳腺癌的癌細(xì)胞，定位于胞漿，但少數(shù)也可表達(dá)在細(xì)胞核，而在乳腺增生組織中幾乎不表達(dá)(見(jiàn)圖1)，MACC1在UDH、ADH、DCIS、IDC陽(yáng)性表達(dá)率分別為0%、0%、13.33%、81.82%；Securin蛋白主要表達(dá)于乳腺癌的癌細(xì)胞，定位于胞漿，而在乳腺增生組織中幾乎不表達(dá)(見(jiàn)圖2)。

圖1 不同乳腺組織中macc1的表達(dá) (免疫組化envision兩步法) a： udh組織中陰性表達(dá)(×100)；b: dcis組織中弱陽(yáng)性表達(dá)(×200)；c: idc淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組織中強(qiáng)陽(yáng)性(2+)表達(dá)(×200)；d: idc淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組織中強(qiáng)陽(yáng)性(3+)表達(dá)(×200)

圖2 不同乳腺組織中Securin的表達(dá)(免疫組化染色EnVision兩步法) a：UDH組織中陰性表達(dá)(×100)；b: DCIS組織中弱陽(yáng)性表達(dá)(×200)；c: IDC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(×200)

2.2 不同臨床病理參數(shù)中MACC1與Securin蛋白的表達(dá)比較不同腫瘤的直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、乳腺組織類(lèi)型中MACC1與Securin蛋白的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)中MACC1與Securin蛋白的表達(dá)比較 (n)

2.3 不同乳腺組織中MACC1 mRNA、Securin mRNA的表達(dá)情況MACC1 mRNA、Securin mRNA在不同乳腺組織中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。其中MACC1 mRNA、Securin mRNA分別在乳腺增生組與癌組中的表達(dá)(χ2=45.414，48.894)；在原位癌組與浸潤(rùn)癌組中的表達(dá)(χ2=105.803，111.892)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組與陽(yáng)性組中的表達(dá)比較(χ2=98.868，109.247)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表3。RT-PCR檢測(cè)MACC1 mRNA、Securin mRNA在不同乳腺組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖3。

表3 不同乳腺組織中MACC-1 mRNA、Securin mRNA的表達(dá)情況 [n(%)]

2.4 乳腺癌組織中MACC1 與Securin的相關(guān)性分析在70例乳腺癌組織中MACC1和Securin的表達(dá)相關(guān)(r=0.785；r=0.642，均P<0.001)，見(jiàn)表4、表5。

表4 Securin mRNA與MACC1 mRNA的相關(guān)性

表5 MACC1蛋白與Securin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌已成為嚴(yán)重危害女性健康的“頭號(hào)殺手”，其發(fā)病率和死亡率均高居首位。雖然目前已有手術(shù)切除、放療、化療、內(nèi)分泌治療及免疫治療等多種有效的治療手段使得乳腺癌患者的生存情況得到了極大的改善，但部分患者因復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，預(yù)后仍然較差。因此，與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)的分子基礎(chǔ)和信號(hào)途徑的研究對(duì)于該疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療有著重要的指導(dǎo)性作用，即規(guī)范和精準(zhǔn)地治療乳腺癌對(duì)提高患者的生存率意義重大。

研究表明，正常組織中HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎發(fā)育和組織損傷修復(fù)中起重要作用[5]。此外，HGF/c-Met信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、遷徙、血管生成、上皮細(xì)胞間質(zhì)化過(guò)程中也起重要作用, 但是它的異常激活與惡性腫瘤的發(fā)生，特別是惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道MACC1可以在轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)c-Met的表達(dá)，使HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[7]。張巍[8]的研究表明，MACC1可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，增加胃癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)能力。此外，熊晶等[9]的研究表明，MACC1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且此蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)；MACC1高表達(dá)的患者總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均較短；MACC1可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，在乳腺癌預(yù)后評(píng)估中具有一定的價(jià)值。本課題研究顯示，MACC1在乳腺增生組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在乳腺導(dǎo)管原位癌中及未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)癌中高表達(dá)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的表達(dá)更高、更明顯，與以上研究結(jié)果相符。此外，本課題從乳腺增生組織到乳腺癌的病變進(jìn)展組織中，可以看到MACC1不論是分子水平的mRNA表達(dá)還是免疫組化的蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)出梯度遞增的表達(dá)狀態(tài)，從而提示MACC1在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了重要作用，因此推測(cè)MACC1對(duì)判斷乳腺癌的進(jìn)展具有重要意義，且有可能成為潛在的靶點(diǎn)，為乳腺癌的治療提供一些新思路。

正常組織中Securin在睪丸與胸腺中表達(dá)水平較高，而在胎盤(pán)、結(jié)腸、小腸、大腦、胰腺中低水平表達(dá)。此外，Securin還參與了細(xì)胞的有絲分裂、凋亡以及DNA修復(fù)等關(guān)鍵的細(xì)胞活動(dòng)[10]，在有絲分裂后期，Securin蛋白N末端的毀壞盒與后期促進(jìn)復(fù)合物連接，并在多種酶類(lèi)參與下被泛素化降解，從而使分離酶活化[2]。Securin的高表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的多倍體性，而Securin的缺失則可引起基因的不穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)，Securin的在多種內(nèi)分泌腺體及腺體相關(guān)惡性腫瘤中表達(dá)異常，如腦垂體瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等，并且還與腫瘤的惡性程度相關(guān)[11]。然而Securin在乳腺癌中的研究相對(duì)較少，為了探索它在乳腺癌中的表達(dá)以及是否和乳腺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)，我們?cè)赟elam等[12]研究基礎(chǔ)上，增加了導(dǎo)管原位癌組織樣本，相繼研究不同乳腺組織中Securin在分子及蛋白水平的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Securin在乳腺增生組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在乳腺導(dǎo)管原位癌中及未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)癌中異常高表達(dá)，而在已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的表達(dá)更高、更明顯。因此Securin在乳腺癌的病變進(jìn)展組織中無(wú)論是在分子水平還是蛋白水平都呈現(xiàn)出梯度遞增的表達(dá)狀態(tài)。此外，吳秋等[13]研究也顯示，Securin與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Gurvits等[14]研究表明，securin的表達(dá)可作為乳腺癌患者強(qiáng)有力且獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，尤其是對(duì)在生物學(xué)和臨床上具有挑戰(zhàn)性的三陰性乳腺癌。因此，基于以上研究結(jié)果我們推測(cè)Securin也有可能是一種潛在的預(yù)測(cè)乳腺癌進(jìn)展的新型標(biāo)記物。

綜上所述，MACC1與Securin雖非同一通路、同一作用機(jī)制的相關(guān)因子，但是在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，本研究發(fā)現(xiàn)MACC1與Securin蛋白的表達(dá)在不同腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且MACC1與Securin在乳腺癌中基因及蛋白水平的表達(dá)相關(guān)。因此，在乳腺癌組織中聯(lián)合檢測(cè)MACC1與Securin的表達(dá)情況，可以給我們提供重要的預(yù)測(cè)信號(hào)，了解乳腺癌患者疾病的進(jìn)展情況，也有望為乳腺癌的分子靶向治療提供新的靶點(diǎn)。