食管胃交接部腺癌患者T細(xì)胞表達(dá)與病理參數(shù)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究

李東輝,李 杰,王艷偉

(邯鄲市第一醫(yī)院紡醫(yī)院區(qū) 綜合外科，河北 邯鄲056004)

食管胃交接部腺癌(AEG)位于食管、胃的移行區(qū)，兼有食管癌與胃癌的特征，該部位的腺癌可侵入賁門，并由賁門癌向上侵入食管下段，導(dǎo)致交接部癌、食管腺癌、賁門腺癌的重疊性發(fā)生，病情復(fù)雜、腫瘤分類錯(cuò)綜[1-2]。AEG發(fā)病因素眾多，目前比較明確的有肥胖、Barrett食管、胃食管反流，手術(shù)治療是本病的主要治療手段，其中根治切除(在保證安全的基礎(chǔ)上完全切除原發(fā)腫瘤及徹底清掃可能轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié))是目前最有效的方式，然而AEG特殊的生物學(xué)行為使得單純手術(shù)治療的5年生存率僅為10%-38.7%之間，70%的患者發(fā)生了胸膜、肝臟、腹膜的轉(zhuǎn)移[3-6]。有研究顯示，AEG在早期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則5年生存率一般低于30%，若在進(jìn)展期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則5年生存期<15%[7-8]。20世紀(jì)末，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在由腫瘤引發(fā)的T淋巴細(xì)胞亞群抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，且隨著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)被認(rèn)識(shí)，免疫系統(tǒng)在監(jiān)控腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義日漸顯著[9-10]。腫瘤發(fā)生時(shí)，人體免疫耐受、抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)等被激活，繼而發(fā)生免疫抑制現(xiàn)象。本研究采用免疫組化分析法對(duì)AEG患者的T細(xì)胞進(jìn)行觀察，探討免疫系統(tǒng)與AEG發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013年1月至2016年6月邯鄲市第一醫(yī)院紡醫(yī)院區(qū)收治的AEG患者120例為研究對(duì)象。其中，男性90例，女性30例；年齡40-74歲，平均(60.57±8.47)歲；腫瘤最大直徑1.0-20.0 cm，平均(6.04±0.07) cm；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ-Ⅱ期患者85例，Ш期患者35例；組織學(xué)分化中高分化者62例，低分化者58例。根據(jù)標(biāo)本采集部位對(duì)患者進(jìn)行分組，AEG組取食管胃交接部腺癌標(biāo)本，共70例；對(duì)照組取腫瘤組織旁2-3 cm范圍內(nèi)的正常組織，共50例。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《食管胃結(jié)合部腺癌外科治療中國(guó)專家共識(shí)》[11]關(guān)于AEG的診斷標(biāo)準(zhǔn),以及超聲內(nèi)鏡、病理學(xué)確診；患者術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)放化療和其他抗癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往進(jìn)行過(guò)手術(shù)、放化療而復(fù)發(fā)的AEG患者，預(yù)估生存期<3個(gè)月的AEG患者，合并有其他惡性腫瘤者，具有嚴(yán)重心腦血管、肝腎功能衰竭者。所有入選者及其家屬均對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情、了解，并簽署知情同意書(shū)；本次研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開(kāi)展。

1.2 方法

1.2.1免疫組化法步驟 對(duì)手術(shù)中采集的標(biāo)本進(jìn)行多聚甲醛固定、石蠟包埋，并連續(xù)切片，HE染色核實(shí)病理診斷。采用免疫組化SP法對(duì)CD8、Foxp3進(jìn)行染色，具體步驟為：組織切片，70°溫箱中烤片3-12 h，脫蠟、水沖洗3 min，切片置于濕片盒中PBS沖洗，高溫水浴法抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，切片置于濕盒中PBS沖洗，滴加一抗，濕盒放置常溫下15 min，PBS沖洗，滴加二抗，PBS沖洗，顯色，25℃下蘇木素染色5 min，75%乙醇0.5 min 1次、95%乙醇0.5 min 1次、100%乙醇0.5 min 1次、二甲苯3 min 2次后樹(shù)脂封片。

1.2.2結(jié)果判定 400高倍鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)選擇6個(gè)視野腫瘤細(xì)胞進(jìn)行觀察，采用半定量計(jì)分法進(jìn)行判定，0分為陽(yáng)性細(xì)胞比例≤5%、1分為陽(yáng)性細(xì)胞比例>5%且≤25%、2分為陽(yáng)性細(xì)胞比例>25%且≤50%、3分為陽(yáng)性細(xì)胞比例>50%且≤75%、4分為陽(yáng)性細(xì)胞比例>75%。陽(yáng)性細(xì)胞判定：細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色、黃色顆粒為CD8陽(yáng)性，細(xì)胞核出現(xiàn)黃褐色或黃色顆粒為Foxp3陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)中由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行讀片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AEG組與對(duì)照組中CD8+與Foxp3的表達(dá)比較

從表1可以看出，AEG組的CD8+陽(yáng)性率為58.57%(41/70)、Foxp3的陽(yáng)性率為74.29%(52/70)，對(duì)照組的CD8+陽(yáng)性率為4.00%(2/50)、Foxp3的陽(yáng)性率為14.00%(7/50)。組間比較，AEG組的CD8+與Foxp3陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

在腫瘤組織中CD8+與Foxp3均呈陽(yáng)性表達(dá)的患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。AEG組中同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)的為29例，陽(yáng)性率為41.43%；同時(shí)呈陰性表達(dá)的為2例，陰性率為2.86%。Foxp3為陽(yáng)性表達(dá)、CD8+為陰性表達(dá)的為25例，CD8+為陽(yáng)性表達(dá)、Foxp3為陰性表達(dá)的為14例。

表1 AEG組與對(duì)照組CD8+與Foxp3的表達(dá)

2.2 AEG組患者CD8+及Foxp3表達(dá)與臨床病理關(guān)系

在AEG組中TNM分期的Ⅰ-Ⅱ期患者共40例，Ⅲ期患者30例；組織學(xué)分化中高分化者33例，低分化者37例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共43例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例。

CD8+在TNM分期中Ⅰ-Ⅱ期的陽(yáng)性率為50%(20/40)、Ⅲ期為76.67%(23/30)；Ⅰ-Ⅱ期與Ⅲ期比較差異顯著(χ2=5.145，P<0.05)。CD8+在中高分化組織中的陽(yáng)性率為42.42%(14/33)、低分化的陽(yáng)性率為59.46%(22/37)；中高分化與低分化比較差異不顯著(χ2=2.026，P>0.05)。CD8+在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率為55.81%(24/43)，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率為29.63%,兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.214，P<0.05)。

Foxp3在TNM分期中Ⅰ-Ⅱ期的陽(yáng)性率為55%(22/40)、Ⅲ期為90%(27/30)，Ⅰ-Ⅱ期與Ⅲ期比較差異顯著(χ2=10.000，P<0.05)。Foxp3在中高分化組織中的陽(yáng)性率為51.52%(17/33)、低分化的陽(yáng)性率為70.27%(26/37)，中高分化與低分化比較差異不顯著(χ2=2.590，P>0.05)。Foxp3在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率為76.74%(33/43)，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率為37.04%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.605，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CD8+與Foxp3在AEG組表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

2.3 AEG組患者CD8+與Foxp3表達(dá)與5年生存率關(guān)系

本研究中AEG組患者經(jīng)腹入路行根治性切除術(shù)，5年及以上生存者17例，5年以下生存者為53例。生存期<5年的CD8+表達(dá)陽(yáng)性率為37.74%(20/53)，≥5年的CD8+表達(dá)陽(yáng)性率為41.18%(7/17)；生存期<5年與≥5年的CD8+表達(dá)陽(yáng)性率比較差異不顯著(χ2=0.064，P>0.05)。生存期<5年的Foxp3表達(dá)陽(yáng)性率為69.81%(37/53)，≥5年的Foxp3表達(dá)陽(yáng)性率為23.53%(4/17)；生存期<5年與≥5年的Foxp3表達(dá)陽(yáng)性率比較差異顯著(χ2=11.362，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CD8+與Foxp3表達(dá)與AEG組患者5年生存率關(guān)系

3 討論

免疫耐受、免疫逃逸在腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其相關(guān)作用機(jī)制的研究已十分廣泛。Treg是一群同時(shí)具有免疫抑制和免疫低反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，在維持外周免疫耐受、預(yù)防自身免疫性疾病、阻斷移植排斥反應(yīng)中均發(fā)揮著重要作用。Treg對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答具有較強(qiáng)的抑制作用，在抵抗機(jī)體抗腫瘤免疫中具有重要作用，是腫瘤免疫逃逸的重要因素。有研究認(rèn)為，Treg通過(guò)穿孔素-顆粒媒介的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞表面表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白介素分泌等途徑實(shí)現(xiàn)免疫抑制[12-14]?？乖璅oxp3是Treg的特異性標(biāo)志物，有研究顯示Treg彌散分布在CD8+T細(xì)胞區(qū)域[15]，故在本次研究中選擇CD8+、Foxp3作為AEG患者的主要觀察指標(biāo)，探討T細(xì)胞表達(dá)與本病病理特點(diǎn)、預(yù)后的關(guān)系。

從本次研究結(jié)果來(lái)看，CD8+與Foxp3在AEG腫瘤組織中的陽(yáng)性率均明顯高于癌旁的正常組織，其中Foxp3表達(dá)陽(yáng)性較高，且在對(duì)CD8+與Foxp3兩項(xiàng)同時(shí)觀察時(shí)，兩者同時(shí)為陰性的占比僅為2.86%，說(shuō)明CD8+與Foxp3在特定區(qū)域腺癌中具有高表達(dá)特征，尤以Foxp3陽(yáng)性表達(dá)為顯著。有學(xué)者在對(duì)肝癌小鼠進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)CD8+T細(xì)胞在體外刺激分泌IFN-γ的功能可恢復(fù)，由于Treg常彌散在CD8+T細(xì)胞區(qū)域，因此推測(cè)腫瘤組織中Treg通過(guò)抑制CD8+T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)展[16-17]。從病理關(guān)系來(lái)看，CD8+與Foxp3均在TNM分期中Ⅲ期陽(yáng)性表達(dá)性較高，說(shuō)明二者在辨別AEG分期、組織學(xué)中具有重要意義。

胃與食管結(jié)合部解剖部位特殊、淋巴引流復(fù)雜，有統(tǒng)計(jì)顯示AEG的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá)57%-79%[18]；張彥軍[19]在對(duì)393例AEG患者進(jìn)行病理學(xué)特征觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，275例患者發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為70%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者預(yù)后的重要影響因素，對(duì)AEG患者淋巴轉(zhuǎn)移規(guī)律的研究十分重要。在本次研究中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CD8+、Foxp3陽(yáng)性率均高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中Foxp3陽(yáng)性率最高。在對(duì)患者進(jìn)行5年生存期觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，AEG患者生存期<5年的Foxp3陽(yáng)性率較高，說(shuō)明該指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)AEG患者預(yù)后具有一定參考性。相關(guān)研究顯示，肺癌患者的Foxp3表達(dá)參與了抑制腫瘤特異性T細(xì)胞增殖的過(guò)程，在胃腸道惡性腫瘤晚期患者血液中Treg含量明顯高于早期患者，這些結(jié)果與本研究共同說(shuō)明Treg在推動(dòng)腫瘤發(fā)展中具有重要作用，是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。

綜上所述，AEG腫瘤組織中CD8+與Foxp3均有較高的陽(yáng)性率，且以Foxp3表達(dá)最為明顯，二者對(duì)于判斷AEG患者預(yù)后具有一定價(jià)值。在接下來(lái)的研究中，擬對(duì)多中心AEG患者的腫瘤病理表現(xiàn)與T細(xì)胞關(guān)系進(jìn)行觀察，進(jìn)一步探討AEG發(fā)展特點(diǎn)與機(jī)制，為臨床治療提供更具針對(duì)性的理論依據(jù)。