中國(guó)西北地區(qū)漢族苯丙酮尿癥患者苯丙氨酸羥化酶基因突變分析

何 江，強(qiáng) 榮，毛新梅，王慧珍，閆有圣，鄒紅云，史清海*

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊830000；2.陜西省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，陜西 西安710003；3.寧夏回族自治區(qū)婦幼保健院 新生兒疾病篩查中心，寧夏 銀川750011；4.青海省婦幼保健院 新生兒疾病篩查中心,青海 西寧810000；5.甘肅省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，甘肅 蘭州730050)

苯丙酮尿癥(PKU)是一種常染色體隱性遺傳病，屬于苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺乏癥之一，是PAH基因突變導(dǎo)致酶活性降低或喪失，苯丙氨酸(Phe)在體內(nèi)無(wú)法正常代謝而異常蓄積及其旁路代謝產(chǎn)生的有害性代謝物質(zhì)引起患者嚴(yán)重智力低下及神經(jīng)行為異常[1]。目前，在PAH基因的13個(gè)外顯子(exon，E)以及內(nèi)含子(intron，I)、5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)和3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)等區(qū)域發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)義突變、小缺失、剪切位點(diǎn)突變、沉默突變、無(wú)義突變、小插入及大片段插入等致病突變形式[2-3]。截至2020年7月22日，世界范圍內(nèi)報(bào)道的PAH基因突變已達(dá)1188種(http://biopku.org/pah/search-results-browse.asp)，不同國(guó)家和民族的PAH基因種類(lèi)和頻率差異明顯，這為全面闡述各地區(qū)及種族PKU發(fā)病的分子機(jī)制奠定了遺傳基礎(chǔ)。本研究對(duì)西北地區(qū)確診的223例漢族PKU患兒進(jìn)行PAH基因突變分析，旨在探究西北地區(qū)漢族PKU患者PAH基因的突變規(guī)律及分布特點(diǎn)，歸納總結(jié)出西北地區(qū)漢族PKU患者的PAH基因突變譜，對(duì)于指導(dǎo)本地區(qū)產(chǎn)前診斷、攜帶者篩查及了解PAH基因的進(jìn)化、漂移非常重要，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源選取2003年1月-2019年8月經(jīng)西北五省區(qū)新生兒疾病篩查中心或醫(yī)學(xué)遺傳中心篩查繼而確診的223例漢族PKU患者，包括新疆71例，陜西55例，青海32例，寧夏35例，甘肅30例。其中，男114例，女109例，年齡范圍從2個(gè)月至15歲，平均年齡(3.3±0.7)歲。初診血清Phe濃度為226-2430 μmol/L。確診標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)出生72小時(shí)后充分哺乳新生兒采集足跟血，對(duì)門(mén)診患兒采集靜脈血，測(cè)定Phe濃度>120 μmol/L者進(jìn)行召回復(fù)查，復(fù)查Phe濃度仍然>120 μmol/L，首先確診為高苯丙氨酸血癥(HPA)，再采集患兒血樣及尿液標(biāo)本進(jìn)行血二氫蝶呤還原酶測(cè)定、四氫生物蝶呤(BH4)負(fù)荷試驗(yàn)(>600 μmol/L)或者Phe和BH4聯(lián)合負(fù)荷試驗(yàn)(≤600 μmol/L)及尿蝶呤譜分析，排除四氫生物蝶呤缺乏癥、一過(guò)性高苯丙氨酸血癥和酪氨酸血癥等。對(duì)Phe>600 μmol/L患兒行低苯丙氨酸飲食控制治療。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 檢測(cè)方法標(biāo)本采集及DNA提?。撼槿』純杭案改竿庵莒o脈血1 ml，滴于濾紙上呈3-5個(gè)濾紙斑，陰涼干燥避光處晾干，1-2 h后裝入無(wú)菌干凈密封袋內(nèi)備用。采用血片快速酚/氯仿抽提法，提取基因組DNA保存于-20℃?zhèn)溆?；PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定：PAH基因啟動(dòng)子及第1-13外顯子的引物序列參照文獻(xiàn)[4]，嚴(yán)格按照引物序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)完成。PCR擴(kuò)增參數(shù)及具體操作步驟參照文獻(xiàn)[5]。采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，樣品純化及序列分析應(yīng)用美國(guó)ABI 3130 XL型序列分析儀完成。每個(gè)測(cè)序樣品進(jìn)行兩次PCR，分別測(cè)定正、反方向的基因序列，所有序列變異位點(diǎn)均針對(duì)該位點(diǎn)，檢測(cè)患者父母的DNA序列，以確定序列變異來(lái)源。如有新突變同時(shí)對(duì)患者雙親進(jìn)行序列分析。

1.3 突變命名和驗(yàn)證已知突變的命名結(jié)合測(cè)序結(jié)果參照http://pahab.mcgill.ca提供的突變名稱(chēng)命名。新突變的命名參照http://www.hgvs.org /mutnomen提供的命名法來(lái)命名。新序列變異通過(guò)查閱國(guó)際PAH數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.biopku.org/pah)、國(guó)際人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)專(zhuān)業(yè)版Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed)來(lái)確定，所有新變異均通過(guò)100名健康無(wú)關(guān)個(gè)體相應(yīng)外顯子測(cè)序排除為多態(tài)性位點(diǎn)后被認(rèn)定為新突變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西北地區(qū)漢族PKU患者PAH基因突變分布及特點(diǎn)

西北地區(qū)漢族PKU患者PAH基因致病突變檢出率為88.6%(395/446)，在446條等位基因中共檢測(cè)出75種PAH基因致病突變，來(lái)自外顯子的有66種(88.0%)，來(lái)自內(nèi)含子的有9種；共涉及5種突變形式，其中，錯(cuò)義突變50種(66.7%)、剪切位點(diǎn)突變12種(16.0%)，無(wú)義突變7種(9.3%)，移碼突變4種(5.3%)，缺失突變2種(2.7%)。本研究中，除了外顯子1和外顯子13之外，在其他外顯子中均檢測(cè)到外顯子突變，還在內(nèi)含子4、內(nèi)含子7、內(nèi)含子8、內(nèi)含子10、內(nèi)含子11、內(nèi)含子12中檢測(cè)到46個(gè)剪切位點(diǎn)突變(10.3%)，其中PAH基因致病突變主要分布在E7(29.0%)、E6(10.5%)、E3(10.3%)、E11(9.6%)、E12(8.5%)、I4(6.7%)和E2(4.5%)。突變頻率較高的PAH基因致病突變是R243Q(22.1%)、IVS4-1G>A(6.7%)、EX6-96A>G(6.5%)、R111X(5.4%)、R53H(4.3%)、Y356X(4.0%)、R413P(3.8%)、V399V(3.1%)、IVS7+2T>A(1.8%)，這些常見(jiàn)突變約占基因突變的57.7%，其余突變均為散在發(fā)生(<2.0%)。

2.2 西北地區(qū)漢族PKU患者PAH基因常見(jiàn)致病突變檢出率與其他國(guó)家及地區(qū)比較

如表1所示，西北漢族PKU患者最常見(jiàn)的PAH基因突變是R243Q，與中國(guó)北方基本一致，但明顯區(qū)別于日本(R413P)、巴西(V388M)及德國(guó)(R408W)、立陶宛(R408W)、美國(guó)(R408W)。西北漢族PKU患者PAH基因突變構(gòu)成與中國(guó)北方類(lèi)似，但顯著區(qū)別于日本、德國(guó)、美國(guó)、巴西、立陶宛等亞洲及歐美國(guó)家。

表1 西北地區(qū)漢族PKU患者PAH基因常見(jiàn)致病突變檢出率與其它國(guó)家及地區(qū)的比較

2.3PAH基因新突變發(fā)現(xiàn)

經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及PAH數(shù)據(jù)庫(kù)，在西北漢族檢測(cè)出的N93fsX5(c.279_282delCATC)、G171E(c.512G>A)、P225S(c.673C>T)、Q304K(c.910 C>A)、H107R(c.320 A>G)、F392I(c.1174 T>A)和N223I(c.668A>T)是國(guó)際上尚未見(jiàn)報(bào)道的新的PAH基因突變，并已提交國(guó)際PAH突變基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.biopku.org/pah/)登記。N93fsX5突變(圖1)是由于在PAH基因編碼區(qū)279-282核苷酸之間發(fā)生了CATC 4個(gè)堿基的缺失，導(dǎo)致第93位氨基酸由天冬酰胺(Asn)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)，同時(shí)引發(fā)由此往后排列編碼的第5位氨基酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼，屬于第3外顯子上的移碼突變；G171E突變(圖2)是由于編碼區(qū)第512位堿基由G變?yōu)锳，導(dǎo)致第171位氨基酸由甘氨酸(Gly)變?yōu)楣劝彼?Glu)，為第6外顯子上的錯(cuò)義突變；P225S突變(圖3)是由于PAH基因編碼區(qū)第673位堿基(第6外顯子)由C變?yōu)門(mén)，發(fā)生第6外顯子上的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第225位氨基酸由脯氨酸(Pro)變?yōu)榻z氨酸(Ser)；Q304K突變(圖4)是由于PAH基因編碼區(qū)第910位堿基由C變?yōu)锳，導(dǎo)致第304位氨基酸由谷氨酰胺(Gln)變?yōu)橘嚢彼?Lys)，為第8外顯子上的錯(cuò)義突變；H107R突變(圖5)由于PAH基因編碼區(qū)第320位堿基由A變?yōu)镚，導(dǎo)致第107位氨基酸由組氨酸(His)變?yōu)榫彼?Arg)，為第3外顯子上的錯(cuò)義突變；F392I突變(圖6)是由于PAH基因編碼區(qū)第1174位堿基由T變?yōu)锳，導(dǎo)致第392位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)變?yōu)楫惲涟彼?Ile)，為第11外顯子上的錯(cuò)義突變；N223I突變(圖7)是由于PAH基因編碼區(qū)第668位堿基由A變?yōu)門(mén)，導(dǎo)致第223位氨基酸由天冬酰胺(Asn)變?yōu)楫惲涟彼?Ile)，為第6外顯子上的錯(cuò)義突變。

3 討論

本研究在西北地區(qū)漢族PKU患者PAH基因的11個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子中共發(fā)現(xiàn)75種致病突變，在外顯子中檢出率最高(88.0%)，主要突變形式有5種，但主要以錯(cuò)義突變、剪切位點(diǎn)突變和無(wú)義突變?yōu)橹?占比92.0%)。無(wú)論是突變種類(lèi)數(shù)還是突變形式均顯著區(qū)別于伊朗[12]、意大利[13]、西班牙[14]、巴西[11]、美國(guó)[10]等其他亞洲、歐洲和美洲國(guó)家。這充分表明PAH基因中任何堿基的突變都可能導(dǎo)致酶活性的降低或缺失，導(dǎo)致PKU發(fā)生，表現(xiàn)出突變遺傳異質(zhì)性的復(fù)雜多樣性[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)西北地區(qū)漢族PAH基因致病突變主要分布在E7(29.0%)、E6(10.5%)、E3(10.3%)、E11(9.6%)、E12(8.5%)、I4(6.7%)和E2(4.5%)，這與歐洲人更多集中在第3、10和12外顯子明顯不同[9]，提示進(jìn)行PKU早期篩查和基因診斷時(shí)應(yīng)首先選擇這些PAH基因突變熱點(diǎn)外顯子和內(nèi)含子區(qū)域。西北地區(qū)漢族PKU患者中居于首位的PAH基因突變?yōu)镽243Q(22.1%)，與中國(guó)北方[6]、韓國(guó)[8]基本一致，但明顯區(qū)別于日本[7]、巴西[11]最常見(jiàn)突變分別為R413P、V388M，也區(qū)別于德國(guó)[9]、立陶宛[9]、美國(guó)[10]等歐美國(guó)家最常見(jiàn)的R408W突變。

圖1 PAH基因外顯子3 N93fsX5(c.279_282delCATC，p.Asn93LysfsX5)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖2 PAH基因外顯子6 G171E(c.512G>A，p.Gly171Glu)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖3 PAH基因外顯子6 P225S(c.673C>T，p.Pro225Ser) 雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖4 PAH基因外顯子8 Q304K(c.910 C>A,p.Gln304Lys)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖5 PAH基因外顯子3 H107R(c.320 A>G,p.His107Arg)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖6 PAH基因外顯子11 F392I(c.1174 T>A,p.Phe392Ile)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖7 PAH基因外顯子6 N223I(c.668A>T,p.Asn223Ile)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

此外，本研究發(fā)現(xiàn)的常見(jiàn)突變還包括EX6-96A>G(6.7%)、IVS4-1G>A(6.7%)、R111X (5.4%)、R53H(4.2%)和Y356X(4.0%)等突變，PAH基因突變分布構(gòu)成與中國(guó)北方、韓國(guó)相似，但顯著不同于日本、德國(guó)、美國(guó)等亞洲及歐美國(guó)家，推測(cè)R243Q基因突變頻率的高發(fā)在中國(guó)北方地區(qū)，而歐洲地區(qū)是R408W突變的起源地，這充分證實(shí)不同國(guó)家、地區(qū)及不同民族間PAH基因的突變特點(diǎn)的獨(dú)特性、差異性和復(fù)雜性。

本研究經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及PAH相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.biopku.org/pah等)，還在西北漢族PKU患者中發(fā)現(xiàn)了7種新的PAH基因突變。苯丙氨酸羥化酶通常以具有催化活性的四聚體形式存在，其單體由N端調(diào)節(jié)區(qū)(1-142aa)、催化區(qū)(143-410aa)及C端的四聚體區(qū)(411-452aa)三部分組成，PAH基因突變對(duì)苯丙氨酸羥化酶活性的影響依賴于突變的形式和位置[17]。G171E(青海)、N223I(寧夏)、P225S(新疆)、Q304K(寧夏)、F392I(寧夏)這5種突變均為錯(cuò)義突變，均位于酶單體中α螺旋富集的催化區(qū)，由于某一堿基突變導(dǎo)致相應(yīng)編碼氨基酸改變，影響苯丙氨酸羥化酶分子活性位點(diǎn)的形狀，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以及蛋白質(zhì)的折疊、聚合，導(dǎo)致酶蛋白的活性功能有所降低。H107R(寧夏)突變位于酶單體的N端調(diào)節(jié)區(qū)，為PAH基因第3外顯子上的錯(cuò)義突變，由于編碼區(qū)第320位堿基由A變?yōu)镚，導(dǎo)致第107位氨基酸由組氨酸(His)變?yōu)榫彼?Arg)，改變了苯丙氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)并影響了酶活性功能的正常表達(dá)。N93fsX5(青海)屬于第3外顯子上的移碼突變，是由于在PAH基因編碼區(qū)279-282位核苷酸之間發(fā)生了4個(gè)堿基(CATC) 的缺失，導(dǎo)致由此往后排列編碼第5位氨基酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼，使得合成的肽鏈縮短，從而嚴(yán)重降低了苯丙氨酸酶蛋白的活性發(fā)揮。

歷史的積淀和民族的交融發(fā)展，造就了西北地區(qū)復(fù)雜的遺傳背景，也導(dǎo)致本地區(qū)漢族PAH基因的遺傳和變異形成了自身的特點(diǎn)，無(wú)論是在突變基因種類(lèi)、突變形式以及突變分布規(guī)律上，既包含中國(guó)北方其他省區(qū)常見(jiàn)的突變類(lèi)型及規(guī)律，也能發(fā)現(xiàn)中國(guó)北方及南方其他省區(qū)尚未報(bào)道的新突變，這也從側(cè)面揭示西北漢族歷經(jīng)數(shù)千年歷史發(fā)展，伴隨歷史、地理及民族融合等諸多因素影響，人口來(lái)源多樣繁雜，形成其鮮明的地域特征，這對(duì)于豐富完善我國(guó)漢族PAH基因突變譜提供重要理論依據(jù)，為有效降低西北地區(qū)PKU發(fā)病率，提高出生人口素質(zhì)具有重要價(jià)值。