河南省部分地區(qū)奶牛肉孢子蟲感染的血清學調(diào)查

薛 雙，項朝榮，馬超鋒，閆文朝

(1.駐馬店市動物疫病預防控制中心，河南駐馬店 463001；2.濟源市動物疫病預防控制中心，河南濟源 454650；3.信陽市動物疫病預防控制中心，河南信陽 464000；4 河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471023)

肉孢子蟲病是由肉孢子蟲(Sarcocystisspp.)寄生于多種宿主的肌肉而引起的一種人獸共患原蟲病，豬、牛、羊及鳥類等多種動物均可感染肉孢子蟲。肉孢子蟲屬于孢子蟲綱、真球蟲目、肉孢子蟲科、肉孢子蟲屬，有200多個蟲種，不同蟲種的中間宿主和終末宿主不同。某些蟲種感染動物后無明顯癥狀，有些蟲種可引起動物發(fā)熱、貧血、嗜酸性粒細胞肌炎、流產(chǎn)和死亡等[1-2]。人往往因食用含有蟲體的肉品而感染，出現(xiàn)惡心、發(fā)熱、嘔吐和腹瀉等癥狀[3]。

牛是肉孢子蟲的中間宿主，主要寄生有5種肉孢子蟲，即枯氏肉孢子蟲(S.cruzi)、毛樣肉孢子蟲(S.hirsuta)、人肉孢子蟲(S.hominis)、羅氏肉孢子蟲(S.rommeli)和黑氏肉孢子蟲(S.heydorni)，其中枯氏肉孢子蟲致病性最強[4]。人肉孢子蟲和黑氏肉孢子蟲對人有感染性。國內(nèi)有學者已開展對黃牛和水牛的肉孢子蟲病流行病學調(diào)查[5-7]。本研究采用肉孢子蟲二價融合抗原間接ELISA抗體檢測試劑盒(已申報國家發(fā)明專利)[8]，對河南省13個地市奶牛場開展肉孢子蟲血清學調(diào)查，以掌握奶牛的肉孢子蟲感染情況，為肉孢子蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液樣品 2018年3月至2019年9月，在河南省13個地市58個奶牛場采集血液樣品，采樣牛群劃分為3個生長階段，即犢牛(0～6月齡)、后備牛(6月齡～24月齡)、產(chǎn)奶牛(24月齡以上)，每份2 mL～3 mL，共采樣1 819份，冷藏帶回實驗室。將采集的血液樣品高速離心后，取上層血清保存于1.5 mL離心管中，編號登記，置-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.1.2 檢測試劑 肉孢子蟲重組融合抗原rSAG3-4作為診斷抗原的間接ELISA抗體，檢測試劑盒由河南科技大學動物科技學院動物檢疫實驗室提供。

1.1.3 主要儀器 ELX-800全自動定量繪圖酶標儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；Eppendorf 不同量程單道移液器及25 μL～300 μL多道移液器，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；LC-800低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品；303系列電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海樹立儀器儀表有限公司產(chǎn)品；槍頭、離心管及一次性96孔ELISA反應板，美國Axygen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗體檢測 用肉孢子蟲重組融合抗原rSAG3-4包被96孔板，4℃過夜。次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min；每次試驗應在包被板上設空白對照1孔，陰、陽性對照各1孔，其余為待檢樣品孔；待檢樣品1∶50倍稀釋，每空加入稀釋后樣品100 μL/孔；陰、陽性對照100 μL/孔，空白對照不加樣；反應板置37℃孵育30 min；用大約300 μL洗滌液清洗板孔3次，最后用吸水紙吸干反應板；除空白孔外，反應板每孔加入1∶200倍稀釋的HRP-兔抗牛二抗100 μL，置37℃孵育30 min；洗板，于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100 μL，置37℃孵育30 min；于各反應孔中加入2 mol/L硫酸50 μL，混勻；終止反應10 min內(nèi)用酶標儀完成判讀，空白對照調(diào)零，在450 nm波長處測定OD值。

結(jié)果判定：當陰性對照的OD值<0.2，陽性對照的OD值>1.0，檢測數(shù)據(jù)才是有效的，否則重做試驗。根據(jù)公式S/P=(樣本OD值-陰性對照OD值)/(陽性對照OD值-陰性對照OD值)，當S/P≥0.15時，樣品為陽性；當0.1≤S/P<0.15時，樣品判定為可疑，需要兩次檢測；當S/P<0.1時，樣品為陰性。

1.2.2 統(tǒng)計分析 用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，不同地區(qū)奶牛場肉孢子蟲抗體場陽性率和樣品陽性率、不同生長階段牛群抗體陽性率、不同季節(jié)牛群抗體陽性率進行χ2檢驗分析差異顯著性，P<0.05時差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 河南省奶牛場肉孢子蟲總體感染情況

河南省13個地市58個奶牛場肉孢子蟲平均場陽性率為53.4%，鄭州最高(66.7%)，其次為南陽和新鄉(xiāng)，平均為60%；漯河和信陽未檢測到陽性樣品。1 819份樣品的平均抗體陽性率為23.3%，駐馬店樣品陽性率最高(40.3%)，其次為安陽(35.1%)，陽性率最低為漯河和信陽(表1)。檢測結(jié)果進行統(tǒng)計χ2分析表明，河南不同地區(qū)奶牛場肉孢子蟲場陽性率差異不顯著(P>0.05)，但不同地區(qū)間樣品陽性率均差異極顯著(P<0.01)。

表1 樣品來源及抗體陽性率Table 1 Sample source and antibody positive rate

2.2 河南省不同年齡段奶牛肉孢子蟲感染情況

本次調(diào)查了13個地市58個奶牛場3個生長階段的牛群，其中犢牛392頭，陽性51頭，陽性率13%。后備牛507頭，陽性116頭，陽性率22.9%，產(chǎn)奶牛920頭，陽性257頭，陽性率27.9%。對檢測數(shù)據(jù)進行χ2檢驗,不同生長階段牛群肉孢子蟲抗體陽性率差異極顯著(P<0.01)。

2.3 河南省奶牛不同季節(jié)肉孢子蟲感染情況

每個季節(jié)均有肉孢子蟲陽性檢出，春季調(diào)查數(shù)為626頭，陽性220頭，陽性率35.1%；夏季調(diào)查數(shù)為315頭，陽性55頭，陽性率17.4%；秋季調(diào)查數(shù)為628頭，陽性116頭，陽性率18.5%；冬季調(diào)查數(shù)為250頭，陽性33頭，陽性率13.2%。對檢測數(shù)據(jù)進行χ2分析，表明不同季節(jié)奶牛群肉孢子蟲抗體陽性率差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

本文對奶牛肉孢子蟲感染情況開展流行病學調(diào)查，調(diào)查13個地區(qū)58個奶牛場，奶牛場陽性率為53.4%，樣品陽性率為23.3%。本次調(diào)查將牛群劃分為3個生長階段，均有肉孢子蟲陽性抗體檢出，說明不同年齡段奶牛均可感染，且隨著日齡增大，感染率在增加。從本次調(diào)查結(jié)果來看，一年四季均有牛群感染肉孢子蟲，但是不同季節(jié)感染率有差異，春季感染率最高，夏季、秋季和冬季感染率較接近，其中冬季感染率最低。當前還沒有特效藥物治療肉孢子蟲病，主要采取綜合性防控措施切斷傳播途徑：一是牛場禁止飼養(yǎng)犬貓。犬貓作為肉孢子蟲的終末宿主，在肉孢子蟲的感染中起到重要作用；二是病死動物及時處理，禁止用生肉或者下水飼喂犬貓等動物。

本次采用間接ELISA方法對河南13個地區(qū)58個奶牛場調(diào)查，11個地區(qū)的31個場肉孢子蟲血清學陽性，感染率較高。牛場肉孢子蟲防控要采取措施控制感染：一要擴大采樣范圍，采用分子生物學檢測方法對牛場樣品進行分離鑒定，確定流行蟲種；二要加強牛場肉孢子蟲的防控，從源頭把控牛場安全，嚴格控制傳染源，切斷傳播途徑。