一種牛源扇頭蜱及其攜帶梨形蟲種類鑒定

尹傳松，緱靜敏，欒宇軒，馬 麗，王婉澤，要慧中，杜嘉玥,3，陳韜凝，劉光遠(yuǎn)，林 青,2,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜動物疫病國家重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州 730046；3.西北農(nóng)林科大學(xué)動物醫(yī)院，陜西西安 710068)

蜱(tick)是一種吸血性節(jié)肢動物，作為一種體外寄生蟲，會吸食人和多種動物的血液，并可通過吸血途徑傳播包括病毒、細(xì)菌、原蟲等多種病原體[1]。我國蜱種的多樣性較高，截至2013年國內(nèi)共發(fā)現(xiàn)蜱類119種，約占全球已鑒定蜱種總數(shù)的13.7%[2]。2019年，我國已報道蜱蟲125種，其中硬蜱111種、軟蜱14種[3]。硬蜱是多種病原體的載體，給畜牧業(yè)及公共衛(wèi)生帶來很大危害，甚至引發(fā)人畜共患病[4]。蜱傳疾病對于全球的威脅正在增加，新的病原體不斷被發(fā)現(xiàn)[5]。自1982年以來，共報道了33種新發(fā)蜱媒病原體，這些病原體是由近30種不同蜱種傳播的[6]，其中包括8種斑點(diǎn)熱群立克次體、6種萊姆病螺旋體基因群、11種巴貝斯蟲、1種發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒以及無形體科中的3種埃立克體、3種無形體和1種新立克次體。在新發(fā)現(xiàn)的33種蜱媒病原體中，有15種能引起人類感染[6]。

梨形蟲病(Piroplasmosis)在世界范圍內(nèi)流行，給畜牧業(yè)造成巨大損失。該病的病原體是梨形蟲目(Piroplasmida)、巴貝斯科(Babesiidae)的巴貝斯屬(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)的泰勒屬(Theileria)的原蟲，分別引起巴貝斯蟲病(Babesiosis)和泰勒蟲病(Theileriosis)，它們是重要的蜱傳寄生原蟲，其中許多種類對牛、綿羊、山羊和人具有高致病性[7]。本研究對采自漢中市的牛源蜱蟲進(jìn)行鑒定，對其所攜帶梨形蟲病原(巴貝斯蟲、泰勒蟲)的種類進(jìn)行分子鑒定，為后續(xù)開展蜱類研究以及當(dāng)?shù)仳鐐骼嫘蜗x病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜱蟲樣品 2020年4月至10月在陜西省漢中市采集牛體表寄生蜱共67只，將所有采集到的蜱分別裝入采集管，做好標(biāo)記與編號，帶回實驗室用去離子水反復(fù)沖洗干凈，然后將其置于750 mL/L的酒精中保存于4℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑 節(jié)肢動物基因組DNA提取試劑盒，OMEGA Bio-Tek(廣州)公司；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、6×loading buffer、DNA 標(biāo)準(zhǔn)2 000、溴化乙錠等,寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；TaqDNA Polymerase、10×PCR buffer,康為世紀(jì)公司；無水乙醇等其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 普通光學(xué)顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；體視顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司；高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；PCR儀，杭州博日科技有限公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；全自動紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蜱的形態(tài)學(xué)初步鑒定 用體視顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡，對所采集到蜱的假頭基、背面、腹面、盾板、足基節(jié)、須肢、生殖孔、肛門、肛溝等特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并參照文獻(xiàn)[8]對蜱的種類進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 蜱基因組DNA提取 將所有采集到的蜱使用節(jié)肢動物基因組DNA提取試劑盒提取蜱基因組DNA，提取到的蜱基因組DNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增與測序 利用線粒體16S rDNA的通用引物對蜱進(jìn)行分子鑒定，參照文獻(xiàn)[9]所用的引物：上游引物為F(5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTG-3′)，下游引物為R(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′)。PCR反應(yīng)體系為25 μL：滅菌雙蒸水16.375 μL，10×PCR buffer(15 mmol/L Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物各1 μL，TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.125 μL，DNA樣品2 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃ 5 min；94℃ 40 s，50℃ 40 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴(kuò)增出目的條帶的產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4 蜱攜帶梨形蟲種類的分子檢測 基于梨形蟲18S rRNA基因(430 bp)，采用套式PCR方法對蜱可能攜帶的梨形蟲種類進(jìn)行分子檢測，檢測所用的引物參照文獻(xiàn)[10-11](表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 擴(kuò)增梨形蟲18S rRNA的引物信息Table 1 Primer information of 18S rRNA amplification of Piroplasma

套式PCR擴(kuò)增的第1輪使用引物對RIB-19/RIB-20，第2輪使用引物對BAB-F/BAB-R，且第2輪擴(kuò)增的DNA模板為第1輪PCR的產(chǎn)物。兩輪PCR反應(yīng)參數(shù)一致：94℃ 5 min；92℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 8 min。PCR的反應(yīng)體系與擴(kuò)增蜱蟲基因組的反應(yīng)體系一致。擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.5 序列比對與遺傳進(jìn)化分析 將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站GenBank中的參考序列進(jìn)行比對，使用MEGA-X軟件對蜱16S rDNA基因、梨形蟲18S rRNA基因分別進(jìn)行種系發(fā)育分析，使用鄰接法，設(shè)置Bootstrap的復(fù)制數(shù)為1000，采用Kimura 2-parameter模型分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步確定蜱的種類和蜱攜帶病原梨形蟲的種類。分析蜱16S rDNA基因時選擇的參考序列為微小扇頭蜱(R.microplus)(JX051062、KP210054、MK495912、KC170742、MF351562)，并以新疆草原革蜱(Dermacentornuttalli)(KC203345)、山東長角血蜱(Haemaphysalislongicornis)(KC203360)和埃及血紅扇頭蜱(R.sanguineus)(MF946468)的序列作為外群。而分析梨形蟲18S rRNA基因時選擇的參考序列為東方泰勒蟲(T.orientails)序列(MH208640、AY661513、KX965721、AF081137、KT124538、MG757649)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)序列(KY805832、HQ264127、JX274283)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)序列(KY805829、EF458196、MN053036)，并以環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)(LC547980)和卵形巴貝斯蟲(B.ovata)(KX870098)的序列作為外群。

2 結(jié)果

2.1 蜱種類的鑒定結(jié)果

2.1.1 蜱的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，樣本中的雌蜱假頭寬勝于長，假頭基呈六角形，基突粗短；盾板長勝于寬，略呈五邊形，氣門板長圓形，足長中等；雄蜱假頭短，假頭基六角形，基突短，呈三角形；盾板較窄，未完全覆蓋軀體兩側(cè)，頸溝淺而寬，后中溝較寬而深。綜合以上特征，初步鑒定67只樣本蜱均屬于微小扇頭蜱(R.microplus)。

2.1.2 蜱的16S rDNA PCR擴(kuò)增與測序結(jié)果 基于蜱線粒體16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，得到460 bp左右的核酸片段，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。將測序得的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast序列比對，結(jié)果顯示67個樣本蜱的16S rDNA基因序列與已知的微小扇頭蜱(R.microplus)的序列相似性為99.3%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～8.蜱蟲樣品；N.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Tick samples;N.Negative control圖1 部分蜱16S rDNA序列片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of 16S rDNA sequences in ticks

2.1.3 蜱的系統(tǒng)發(fā)育分析 通過對67只蜱16S rDNA基因的擴(kuò)增與測序，選擇部分代表性樣品序列進(jìn)行種系發(fā)育關(guān)系的構(gòu)建(圖2)。代表性樣本tick1、tick17、tick22和tick43等均與已知的微小扇頭蜱(R.microplus)(JX051062、KP210054、MK495912、KC170742、MF351562)序列聚集在一起形成一個大的分支，相似性為97.11%～99.51%，同屬于微小扇頭蜱。外群新疆草原革蜱(Dermacentornuttalli)(KC203345)、山東長角血蜱(Haemaphysalislongicornis)(KC203360)和埃及血紅扇頭蜱(R.sanguineus)(MF946468)形成獨(dú)立的分支，相互之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。綜上經(jīng)形態(tài)學(xué)初步觀察、序列相似性比對以及系統(tǒng)發(fā)育分析等綜合鑒定，確定本次所采集的67只牛源蜱蟲均為微小扇頭蜱。

每個節(jié)點(diǎn)分支上的數(shù)字表示自展值，本研究中的序列用圓形(●)標(biāo)記 The number on each node branch represents the bootstrap value，The sequences in this study are labeled with circles圖2 基于蜱16S rDNA基因的蜱種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of tick species based on 16S rDNA gene

2.2 蜱攜帶梨形蟲的檢測結(jié)果

2.2.1 梨形蟲18S rRNA PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果 用套式PCR擴(kuò)增梨形蟲18S rRNA基因片段，經(jīng)過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣品出現(xiàn)約430 bp左右的目的條帶(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～6.蜱蟲樣品；N.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-6.Tick samples;N.Negative control圖3 梨形蟲18S rRNA基因套式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Nest PCR amplification results of Piroplasma 18S rRNA

通過PCR擴(kuò)增與測序比對，結(jié)果顯示，在67只樣本蜱中有35只檢測出了梨形蟲，陽性率為52.2%。其中，在1只蜱中檢測到牛巴貝斯蟲，在2只蜱中檢測到雙芽巴貝斯蟲，在32只蜱中檢測到東方泰勒蟲，3種梨形蟲的陽性率分別為1.5%、3.0%和47.7%，本次未檢出有3種病原混合感染的情況。

2.2.2 梨形蟲的遺傳特征分析 基于梨形蟲18S rRNA基因序列，選擇本研究具有代表性的序列與參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。本研究所檢測到的代表性序列 tick12、tick39、tick40、tick44等與GenBank數(shù)據(jù)庫中的東方泰勒蟲(T.orientails)參考序列(MH208640、AY661513、KX965721、AF081137、KT124538、MG757649)聚集在一起形成第1個分支，相似性為98.77%～99.26%。第2個分支為 tick 1的序列與牛巴貝斯蟲(B.bovis)參考序列(KY805832、HQ264127、JX274283)聚集在一起，相似性為98.21%～98.47%。第3個分支為 tick 38、tick47的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)參考序列(KY805829、EF458196、MN053036)聚集在一起，相似性為99.49%～99.74%，以上3個分支與環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)參考序列(LC547980)以及卵形巴貝斯蟲(B.ovata)參考序列(KX870098)均形成不同的分支它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

"●"表示本研究中的樣本序列Sign"●"on behalf of the sample sequences in the present study圖4 基于梨形蟲18S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees based on Piroplasma 18S rRNA gene

3 討論

陜西省蜱的種類豐富多樣，不同區(qū)域有微小扇頭蜱(R.microplus)、長角血蜱(H.longicornis)、銳跗硬蜱(Ixodesacutitarsus)等26種蜱均有分布[12]。本次從漢中市牛體表采集到的蜱經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)鑒定，并利用16S rDNA基因擴(kuò)增出的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，結(jié)果67只樣本蜱全部鑒定為微小扇頭蜱，表明在漢中市牛體表寄生的硬蜱優(yōu)勢種為微小扇頭蜱。

本次檢測到梨形蟲的陽性率高達(dá)52.2%，涉及到牛巴貝斯蟲(B.bovis)、雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和東方泰勒蟲(T.orientails)共3個種類。巴貝斯蟲是一種通過蜱傳播的在紅細(xì)胞內(nèi)寄生的血液原蟲，可感染野生和家養(yǎng)動物[13]。牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲是巴西大部分地區(qū)流行的地方病，對畜牧業(yè)可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中微小扇頭蜱是唯一的傳播媒介[14]。本研究中，微小扇頭蜱攜帶牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和東方泰勒蟲的陽性率分別為1.5%、3.0%和47.7%，由此可知，漢中市牛源微小扇頭蜱感染的梨形蟲種類主要以東方泰勒蟲為主。東方泰勒蟲是經(jīng)蜱傳播后可引起?？苿游锇l(fā)生東方泰勒蟲病的病原，東方泰勒蟲病分布在世界各地[15]。東方泰勒蟲可能會通過微小扇頭蜱進(jìn)行傳播，應(yīng)該采取措施來消除微小扇頭蜱的滋生，并注意在其分布區(qū)域內(nèi)重點(diǎn)對東方泰勒蟲病的防控。