喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

李 超，王明瓊，趙永攀，魏淑娟，董 強(qiáng)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100;2.西藏錯(cuò)那縣農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏錯(cuò)那 856700;3.西藏乃東區(qū)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏乃東 856100;4.陜西省畜牧產(chǎn)業(yè)試驗(yàn)示范中心，陜西涇陽 713700)

抗菌藥在細(xì)菌性感染導(dǎo)致的人類和動(dòng)物疾病預(yù)防和治療中起著無可替代的作用。然而隨著抗菌藥的不合理使用，尤其是在畜牧業(yè)生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的濫用，推動(dòng)了耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和傳播，增加了畜禽的發(fā)病率、死亡率和治療費(fèi)用。對(duì)抗菌藥具有耐藥性的菌株，特別是多重耐藥菌株的傳播，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。喹諾酮類抗菌藥物已成為繼頭孢菌素類抗菌藥物之后抗感染治療應(yīng)用最為廣泛的抗菌藥物，因此其耐藥性問題備受關(guān)注。喹諾酮類抗菌藥作為一種新型的抗菌藥，一直被用作開發(fā)具有廣譜生物活性的新型半合成或合成藥物[1-2]。隨著喹諾酮類及其衍生物在臨床上的使用，喹諾酮類耐藥菌株逐漸出現(xiàn)并增多，內(nèi)蒙古包頭地區(qū)個(gè)別醫(yī)院臨床分離的大腸埃希氏菌株對(duì)喹諾酮的耐藥率達(dá)79%[3]。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA等可在不同種屬細(xì)菌間水平傳播。本文對(duì)喹諾酮類耐藥機(jī)制和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類抗菌藥耐藥基因傳播機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)科研和工作人員提供參考。

1 染色體介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制

1.1 DNA回旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ突變

DNA回旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ在喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)的突變是染色體介導(dǎo)喹諾酮類耐藥的最常見也是最重要的原因之一。喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)域位于大腸埃希氏菌編碼DNA回旋酶GyrA亞基基因的67-106位氨基酸，GyrB亞基基因的426-447位氨基酸之間；編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ ParC亞基基因的63-102位氨基酸，ParE亞基基因420-441位氨基酸之間[4]。DNA回旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ中任何一種亞基的單個(gè)氨基酸發(fā)生突變都會(huì)削弱喹諾酮類藥物與酶之間的相互作用，增加細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性，最常見的兩種突變位于Asp 426 Asn和Lys 447 Glu (大腸埃希氏菌編號(hào))[4]。喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)突變主要位于GyrA亞基和ParC亞基的氨基酸末端，較少位于GyrB亞基和ParE亞基的氨基酸末端[5]。環(huán)丙沙星耐藥菌株主要通過水-金屬離子橋與喹諾酮類藥物發(fā)生特異性相互作用，故其最常見的突變殘基是GyrA/ParC亞基上的Ser和Asp/Glu[6]。對(duì)氟甲喹耐藥分離株中GyrA發(fā)生染色體突變的情況較為少見，而GyrB的突變發(fā)生率較高[7]。也有報(bào)道稱金黃色葡萄球菌中parC(Ser 80 Tyr和Glu 84 Lys/Gly)和gyrA(Ser 84 Leu和/或Glu 88 Lys)的多點(diǎn)突變，導(dǎo)致莫西沙星和環(huán)丙沙星的最小抑制濃度(MIC)比單點(diǎn)突變升高了4倍～16倍[8]，證明多點(diǎn)突變比單點(diǎn)突變更易產(chǎn)生耐藥性。

1.2 AcrAB-TolC外排泵

喹諾酮類藥物可通過革蘭氏陰性菌外膜的孔蛋白途徑擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，從而發(fā)揮抑菌作用。細(xì)菌孔蛋白的丟失、下調(diào)、通道大小和表達(dá)的改變均可減少或阻止抗菌素流入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。AcrAB是革蘭氏陰性菌中廣泛存在的質(zhì)子/藥物反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排泵。在腸桿菌科中，AcrAB-TolC多耐藥外排泵是臨床最重要的外排系統(tǒng)，由內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AcrB)、膜融合蛋白(AcrA)和外膜蛋白通道(TolC)三部分組成，屬于抗藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族(RND)[4]。通過cryo-ET原位膜蛋白結(jié)構(gòu)檢測發(fā)現(xiàn)，在AcrAB-TolC完全組裝泵中TolC∶AcrA∶AcrB的原位比例為3∶6∶3，且部分顆粒中可能不存在TolC，證明TolC可能并非AcrAB-TolC的必要組成部分[9]。耐藥試驗(yàn)表明，AcrAB-TolC泵過表達(dá)的菌株比野生型菌株具有更高的MIC[9]。在細(xì)胞環(huán)境中，AcrA的N-端錨定在內(nèi)膜上，α-發(fā)夾與肽聚糖接觸，在AcrB和TolC之間傳遞，從而調(diào)節(jié)泵的關(guān)閉和打開[9]。不同的調(diào)控基因(如acrR、marA、rob和soxS)均可調(diào)控AcrAB-TolC泵的過表達(dá)，從而減少喹諾酮類藥物的攝取，增加其排出，且OmpF、OmpC、OmpD、OmpA和OmpX孔蛋白表達(dá)的改變，可升高喹諾酮類藥物的MIC[10]。對(duì)117株肺炎克雷伯菌進(jìn)行耐藥基因檢測分析，21%的分離菌株中AcrAB泵的表達(dá)量顯著增加[11]。外排泵介導(dǎo)喹諾酮類耐藥或敏感性降低的細(xì)菌分離株占比高達(dá)75%[7]，從而推測主動(dòng)外排介導(dǎo)的耐藥性為細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制。

1.3 NorA外排泵

NorA是由norA基因編碼的388個(gè)氨基酸組成的單肽跨膜蛋白，其C-端和N-端結(jié)構(gòu)域分別由6個(gè)α螺旋跨膜段組成，呈偽雙對(duì)稱排列，屬于主要促進(jìn)家族，是金黃色葡萄球菌中研究最為廣泛的多耐藥外排泵[12]。NorA被歸類為藥物/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，其過表達(dá)可導(dǎo)致喹諾酮類藥物的大量排出。不同的norA啟動(dòng)子突變可引起基因表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)親水氟喹諾酮類藥物和防腐劑的耐受性增加[13]。NorA只轉(zhuǎn)運(yùn)親水性較強(qiáng)的喹諾酮類藥物(如諾氟沙星和環(huán)丙沙星)，而NorB和NorC轉(zhuǎn)運(yùn)諾氟沙星、環(huán)丙沙星和親水性較弱的化合物(如莫西沙星和左氧氟沙星)[2]。norA基因的過表達(dá)不僅可以直接使環(huán)丙沙星和諾氟沙星的MIC分別提高5倍和40倍[14]，還可促進(jìn)金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥性的進(jìn)化[15]，證明norA基因不僅可以引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，還可促進(jìn)細(xì)菌耐藥性的突變，其是否對(duì)其他耐藥基因的突變具有促進(jìn)作用，值得進(jìn)一步關(guān)注。

2 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制

2.1 qnr基因

第1個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因被命名為qnrA，隨后其相關(guān)耐藥基因qnrB、qnrC、qnrD和qnrS等也被相繼發(fā)現(xiàn)。QnrA作為第1個(gè)被鑒定的Qnr蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)和耐藥機(jī)制也被研究得較為清楚。因QnrA能夠編碼五肽重復(fù)序列蛋白，其被歸類于五肽重復(fù)蛋白家族。最初被發(fā)現(xiàn)可保護(hù)大腸埃希氏菌的DNA回旋酶免受抗菌肽Microcin B17的影響，從而對(duì)抗其他競爭性細(xì)菌的威脅[2]?？咕腗icrocin B17作為腸桿菌科產(chǎn)生的天然抗菌肽毒素，可在不破壞細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的情況下進(jìn)入胞內(nèi)，抑制DNA和RNA合成從而抑制細(xì)菌的生長繁殖[16]。隨著對(duì)保護(hù)分子機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)具有類似DNA的3D結(jié)構(gòu)和β螺旋結(jié)構(gòu)，可與DNA依賴酶競爭性結(jié)合，從抑制喹諾酮類藥物與細(xì)菌的結(jié)合。當(dāng)DNA回旋酶與DNA結(jié)合時(shí)，Qnr可特異性地與回旋酶及GyrA和GyrB結(jié)合，從而降低促旋酶與DNA的結(jié)合能力[17]，但Qnr與回旋酶的結(jié)合位點(diǎn)不同于DNA結(jié)合位點(diǎn)。Qnr蛋白主要通過減低藥物-回旋酶-DNA復(fù)合體的濃度，從而減弱喹諾酮藥物的抑菌能力，產(chǎn)生耐藥性[18]。此外，喹諾酮類藥物作為細(xì)菌SOS應(yīng)答的有效誘導(dǎo)劑，尤其是亞致死濃度的喹諾酮藥物能直接上調(diào)Qnr蛋白的表達(dá)，降低喹諾酮類藥物與DNA回旋酶的結(jié)合能力，并增加細(xì)菌基因的突變率和非同源重組[2]。研究發(fā)現(xiàn)[19]，39株耐藥菌株中，qnrD、qnrS和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因的菌株分別為79.5%，79.5%和71.8%，推測其產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制為qnrD、qnrS和aac(6′)-Ib-cr介導(dǎo)。

2.2 aac(6′)-Ib-cr基因

AAC(6′)-Ib是一種氨基糖苷乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移酶，其變異基因aac(6′)-Ib-cr常見的2個(gè)突變位點(diǎn)為Trp 102 Arg和Asp 179 Tyr，可同時(shí)作用于氨基糖苷類和氟喹諾酮類兩類結(jié)構(gòu)不同的抗菌藥物[17]。aac(6′)-Ib-cr可使含有未取代哌嗪基的喹諾酮類藥物的氨基氮發(fā)生乙?；?，從而降低喹諾酮與靶酶的結(jié)合性，發(fā)揮耐藥作用(如環(huán)丙沙星和諾氟沙星)，但不包括其他喹諾酮類如左氧氟沙星和莫西沙星[17]。此外，AAC(6′)-Ib-cr的N-端包含12種獨(dú)特的氨基酸，不同的突變位點(diǎn)導(dǎo)致不同的喹諾酮類藥物耐藥。有研究檢測到AAC(6′)-Ib-cr的變異體能夠乙酰化吉米沙星和氧氟沙星，但其突變點(diǎn)為Asp 179 Tyr和Ser 117 Leu，卻沒有Trp 102 Arg，表明微小的氨基酸改變可導(dǎo)致耐藥性的差異[20]。因此，對(duì)AAC(6′)-Ib-cr進(jìn)行檢測對(duì)比可能會(huì)對(duì)目前喹諾酮類耐藥機(jī)制有新的認(rèn)知。

2.3 crpP基因

crpP基因是在銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)攜帶的結(jié)合質(zhì)粒pUM505中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因，可導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性，并使大腸埃希氏菌對(duì)環(huán)丙沙星MIC提高7.5倍[10]。環(huán)丙沙星耐藥蛋白(ciprofloxacin resistance protein,CrpP)由65個(gè)氨基酸組成，與恥垢分支桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶具有40%的氨基酸同源性，并含有氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的2個(gè)保守催化殘基[8]。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶作為細(xì)菌產(chǎn)生一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，可作用于氨基糖的特定羥基，使其磷酸化從而使氨基糖苷失活的酶。CrpP可通過ATP依賴機(jī)制磷酸化環(huán)丙沙星，導(dǎo)致抗生素降解，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星產(chǎn)生特異性耐藥性[21]。因crpP基因發(fā)現(xiàn)較晚，其機(jī)制研究尚不太明確，根據(jù)現(xiàn)有研究推測，其可能通過修飾喹諾酮類藥物的羧基與ATP結(jié)合，導(dǎo)致喹諾酮類藥物磷酸化和降解，以改變底物激活或抑制作用，最終引起藥物活性水平的改變。同時(shí)，有推測crpP的起源可能與植物相關(guān)的假單胞菌科有關(guān)[17]。

2.4 QepA外排泵

qepA耐藥基因是在大腸埃希氏菌C316質(zhì)粒pHPA中發(fā)現(xiàn)的新的喹諾酮類耐藥基因，其可編碼QepA外排泵(quinolone efflux pump,QepA)，從而將一些氟喹諾酮類藥物從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌內(nèi)膜外[22]。qepA基因被認(rèn)為是從某些環(huán)境微生物中外源獲得，且常常和rmtB基因在同一個(gè)質(zhì)粒上[22]。QepA蛋白是主要促進(jìn)家族中的一種質(zhì)粒介導(dǎo)的質(zhì)子依賴性外排泵，可降低親水氟喹諾酮類藥物的敏感性，特別是環(huán)丙沙星和諾氟沙星，但無法泵出疏水性喹諾酮類和非喹諾酮類藥物[17]。通過對(duì)雞胴體拭子和解凍液進(jìn)行檢測分析，質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮耐藥基因主要為qepA(22.2%)，且分離株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥性為70%[23]。

2.5 OqxAB外排泵

OqxAB外排泵屬于RND外排系統(tǒng)，由膜融合蛋白OqxA和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OqxB組成，是RND家族中第一個(gè)由質(zhì)粒介導(dǎo)的外排泵[24]。許多質(zhì)粒復(fù)制子(包括IncF、IncH、IncI、IncHI2和IncX)都能轉(zhuǎn)移oqxAB基因，導(dǎo)致oqxAB在多種細(xì)菌中水平傳播。此外，通過基因雜交技術(shù)，在克雷伯菌和拉烏爾氏菌中發(fā)現(xiàn)其染色體攜帶有oqxAB，并與質(zhì)粒oqxAB存在高度同源性[24]。但是將oqxAB基因從染色體轉(zhuǎn)位到質(zhì)粒上，可使oqxAB外排泵表達(dá)量增加80倍以上，從而導(dǎo)致多耐藥性表型[24]。OqxAB外排泵不僅可以介導(dǎo)喹諾酮類耐藥，而且在低濃度喹諾酮類藥物下，可促進(jìn)細(xì)菌高水平耐藥相關(guān)的拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)生突變。研究發(fā)現(xiàn)，同屬于RND家族的TMexCD1-TOprJ1外排泵也可增加細(xì)菌對(duì)喹諾酮的耐藥性[25]。

3 展望

耐藥性基因?qū)㈤L期持續(xù)與人類和動(dòng)物共存。為了解決喹諾酮類藥物的耐藥性，尤其是多耐藥性表型細(xì)菌，必須在世界范圍內(nèi)遵循抗生素合理的使用指南，以控制耐藥性細(xì)菌的持續(xù)產(chǎn)生和傳播。