烏魯木齊市犬體表寄生蜱形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

劉一凡，阿力木江·加帕爾，葉爾保勒，祖力亞·克力木江，韋麗婷，翟雪潔，巴音查汗·蓋力克，王振寶*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.伊寧海關(guān)，新疆伊寧 835000)

蜱屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropod)、蛛形綱(Arachnida)、蜱螨目(Acarina)、蜱亞目(Ixodides)、硬蜱科(Ixodidea)，是廣泛寄生于哺乳動(dòng)物、爬行類、鳥(niǎo)類和兩棲類等脊椎動(dòng)物(魚(yú)類除外)體表的節(jié)肢動(dòng)物[1]。蜱蟲(chóng)作為一種專性吸血的體外寄生動(dòng)物，是僅次于蚊子的第二大蟲(chóng)媒介生物[2]，在全球范圍對(duì)人畜健康造成很大危害[3]。蜱蟲(chóng)在叮咬宿主動(dòng)物的同時(shí)釋放出毒素，儲(chǔ)存和傳播多種嚴(yán)重的自然疫源性疾病及人獸共患病的病原[4-5]，如立克次體、無(wú)形體、犬埃立克體、貝氏柯克斯體、萊姆病螺旋體、巴貝斯蟲(chóng)、泰勒焦蟲(chóng)等[6-7]。我國(guó)常見(jiàn)寄生于犬體表的蜱有血紅扇頭蜱[8]、微小牛蜱[9]、鐮形扇頭蜱、長(zhǎng)角血蜱[10]、鈴頭血蜱和草原血蜱[11-12]，其中以血紅扇頭蜱為優(yōu)勢(shì)蜱種，這說(shuō)明犬是多種蜱種的宿主，這些蜱蟲(chóng)常在雨后潮濕悶熱的環(huán)境中在草地、灌木叢穿行的犬體表大量出現(xiàn)。據(jù)報(bào)道表明，圖蘭扇頭蜱為新疆的優(yōu)勢(shì)蜱種[13]常寄生于羊、牛、馬等家畜[14]，主要分布在新疆的喀什、和田、輪臺(tái)、沙雅、霍城、哈密、庫(kù)爾勒、阿拉山口等荒漠草原和荒漠地區(qū)[15-16]。2015年在新疆伊寧縣現(xiàn)發(fā)現(xiàn)圖蘭扇頭蜱，這可能與新疆北疆地區(qū)近30年雨水量過(guò)少、特殊的植被分布及氣候變化有關(guān)[17]。

對(duì)于烏魯木齊市犬體表蜱蟲(chóng)寄生率及其種群分布特點(diǎn)、蜱蟲(chóng)種類、以及蜱媒傳染病，尤其是新發(fā)蜱媒傳染病的疾病尚不清楚。因此，本試驗(yàn)選取犬體表寄生蜱蟲(chóng)種類作為研究對(duì)象，對(duì)烏魯木齊市犬體表的蜱蟲(chóng)寄生的主要蜱蟲(chóng)寄生率及其種類進(jìn)行了初步調(diào)查和鑒定，旨在為進(jìn)一步研究烏魯木齊市蜱傳病原體帶來(lái)的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜱蟲(chóng)采集 2020年3月至6月在烏魯木齊市多家動(dòng)物醫(yī)院、寵物店、犬舍、流浪狗基地、社區(qū)隨機(jī)選取無(wú)明顯發(fā)病癥狀的犬只作為調(diào)查對(duì)象。采取宿主體表檢查法[3]對(duì)犬頭部、頸部、胸腹部、背部、四肢、腋下、腹股溝、尾部等部位進(jìn)行檢查。經(jīng)檢查獲得的蜱蟲(chóng)，使用止血鉗夾緊蜱蟲(chóng)頭部對(duì)其進(jìn)行采集。將采集到的蜱蟲(chóng)逐一編號(hào)并記錄宿主信息置于恒溫恒濕的陰暗環(huán)境中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 2 × EcoTaqPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 1000，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TIANGEN基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 LEICA M205 FA徠卡體視顯微鏡多重聚焦系統(tǒng)，德國(guó)徠卡儀器(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；RETSCH MM400混合冷凍混合球磨儀，費(fèi)爾德(上海)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；AllegraTM X-22R Centrifuge多功能冷凍臺(tái)式離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；Biometre TProfessional TRIO 48三槽高速熱循環(huán)儀，上海昆士蘭生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 用蒸餾水將采集到的蜱蟲(chóng)反復(fù)沖洗3次后置于700 mL/L乙醇中保存?zhèn)溆?。參照《新疆蜱類志》[14]，利用普通體視顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步觀察，再利用LEICA M205 FA徠卡體視顯微鏡多重聚焦系統(tǒng)進(jìn)一步進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析及蜱種鑒定，對(duì)蜱蟲(chóng)的假頭基、盾板、氣門板、生殖孔、肛側(cè)板、肛溝、基節(jié)等具有形態(tài)學(xué)鑒定意義的部位進(jìn)行觀察對(duì)比并拍攝圖片。

1.2.2 蜱蟲(chóng)DNA提取 從上述形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果中隨機(jī)挑選不同蜱蟲(chóng)種類的蜱蟲(chóng)各4只，依次用乙醇濃度為700、500、300、100 mL/L的乙醇溶液在恒溫培養(yǎng)搖床中搖床沖洗1 h，再使用高壓蒸汽滅菌蒸餾水反復(fù)沖洗，經(jīng)干燥冷凍后利用RETSCH MM400混合冷凍混合球磨儀，將蜱蟲(chóng)磨碎，利用CTAB法提取蜱基因組DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蜱蟲(chóng) 16S rDNA基因擴(kuò)增 參照蜱蟲(chóng)線粒體16S rDNA基因特異性引物[15]，上游引物：5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′，下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′，目的片段大小為460 bp，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2 × EcoTaqPCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)dd H2O至25 μL，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；92℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)35次；72℃ 8 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，分別向PCR產(chǎn)物中加入3 μL 6×Loading buffer，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，使用G:BOX EF凝膠成像分析儀觀察試驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄。

1.2.4 遺傳進(jìn)化分析 委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物(460 bp)進(jìn)行正向測(cè)序。將所測(cè)得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索，應(yīng)用序列分析軟件DNAstar進(jìn)行同源性對(duì)比分析，應(yīng)用MEGA7軟件，采用鄰接算法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 蜱蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定

本試驗(yàn)共調(diào)查烏魯木齊市1 054只犬，在240只犬體表帶蜱，共采集到蜱蟲(chóng)889只，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定方法，共獲得1科1屬2種蜱，分別是扇頭蜱屬Rhipicephalus的血紅扇頭蜱(R.sanguineus)和圖蘭扇頭蜱(R.turanicus)(表1)。

表1 烏魯木齊犬體表蜱蟲(chóng)種類及組成Table 1 Species and composition of ticks on the surface of dogs in Urumqi

2.1.1 血紅扇頭蜱

(1)雄蜱：蟲(chóng)體長(zhǎng)約1.9 mm～3.8 mm，呈紅褐色卵圓形；假頭基呈六角形，寬稍大于長(zhǎng)，側(cè)角發(fā)達(dá)，基突明顯呈小尖齒狀，后緣微凹向上呈半弧形，須肢寬粗短；盾板呈長(zhǎng)卵形，前端較窄后端寬鈍，分布有粗細(xì)不等的刻點(diǎn)，肩突鈍圓，眼不明顯，頸溝深而短，側(cè)溝深而細(xì)長(zhǎng)，自眼后起與第1緣垛相連(圖1A)；肛側(cè)板上段直細(xì)窄，下段后緣呈圓弧形，后緣較寬無(wú)齒突；緣垛明顯，中垛常大于旁邊緣垛，部分蟲(chóng)體有尾突；基節(jié)Ⅰ外距常略短于內(nèi)距，長(zhǎng)而直；基節(jié)Ⅱ～Ⅳ各有一外距呈短齒狀按節(jié)序依次漸?。换?jié)Ⅱ、Ⅲ后內(nèi)角較窄鈍；基節(jié)Ⅳ后內(nèi)角側(cè)有一短突(圖1B)；氣門扳長(zhǎng)逗點(diǎn)形，基部較寬圓，背突逐漸變窄直達(dá)盾板背緣(圖1C)；除跗節(jié)Ⅰ外，跗節(jié)Ⅱ～Ⅳ腹緣末端和亞末端均有小齒(圖1D)。

(2)雌蜱：蟲(chóng)體長(zhǎng)約2.0 mm～3.8 mm，呈卵圓形；假頭基呈六角形，寬大稍于長(zhǎng)，側(cè)角發(fā)達(dá)，基突寬鈍后緣較平直，孔區(qū)小，卵圓形，須肢粗短；盾扳長(zhǎng)略勝于寬，呈紅褐色，后側(cè)緣似微波紋，眼大呈卵圓形突出，于盾扳最寬處；頸溝前端深向后呈八字分開(kāi)，約到盾板中后部，側(cè)溝深長(zhǎng)達(dá)盾板后側(cè)；(圖1E)；基節(jié)Ⅰ外距長(zhǎng)而直短于內(nèi)距；基節(jié)Ⅱ～Ⅳ外距短鈍，依次減??；基節(jié)Ⅱ、Ⅲ后內(nèi)角窄鈍，基節(jié)Ⅳ內(nèi)角有一短突(圖1F)；跗節(jié)Ⅱ～Ⅳ腹緣末端和亞末端有小齒。氣門扳呈逗點(diǎn)形長(zhǎng)大于寬，背突短后緣略凸出(圖1G)；跗節(jié)Ⅰ無(wú)；爪墊較小，近達(dá)爪長(zhǎng)之半(圖1H)。

2.1.2 圖蘭扇頭蜱

(1)雄蜱：蟲(chóng)體長(zhǎng)約1.9 mm～3.5 mm，呈卵圓形褐色，盾板卵圓形，前部較窄，后部圓鈍，兩側(cè)稍突出，表面遍布較多細(xì)刻點(diǎn)；頸溝短而深陷，眼橢圓形靠側(cè)緣；側(cè)溝窄長(zhǎng)明顯，自眼后延伸至第2個(gè)緣垛(圖2A)；須肢粗短；假頭基六角形，寬稍大于長(zhǎng)，測(cè)角圓突，后緣向上微凹；基突較寬大(圖2C)；基節(jié)Ⅰ外距比內(nèi)距稍長(zhǎng)或相等；基節(jié)Ⅱ～Ⅳ外距較小，呈齒狀逐漸變??；基節(jié)Ⅱ內(nèi)距呈脊?fàn)?，基?jié)Ⅲ無(wú)內(nèi)距，基節(jié)Ⅳ有明顯的小齒狀內(nèi)距；肛側(cè)板窄長(zhǎng)，外緣近于垂直，下段明顯向內(nèi)傾斜，內(nèi)緣中下部有淺凹，下方有一明顯齒突；副肛側(cè)板短小，呈錐狀，中垛大于邊垛，有尾突顏色較淺(圖2B)；氣門扳近長(zhǎng)橢圓形，背突寬短，且急劇彎曲，末端呈截形或圓鈍(圖2D)。

(2)雌蜱：蟲(chóng)體長(zhǎng)約2.0 mm～3.5 mm，呈卵圓形，盾板長(zhǎng)勝于寬，近卵圓形，后側(cè)緣微波狀，戶端圓鈍凸出，呈赤褐色帶亮光，眼大呈橢圓形，略微凸起(圖2E)；假頭基寬短，側(cè)角明顯鈍凸，基突短鈍，后緣較平直(圖2G)；基節(jié)Ⅰ外距比內(nèi)距長(zhǎng)偶爾相等，基節(jié)Ⅱ～Ⅳ各具齒狀外距逐漸減?。粌?nèi)距皆無(wú)(圖2F)；氣門扳近逗點(diǎn)形，長(zhǎng)稍微大于寬，背突粗短，末端圓鈍(圖2H)。

A.背面觀♂(15×)；B.腹面觀♂(15×)；C.氣門扳♂(90×)；D.跗節(jié)Ⅳ♂(70×)；E.背面觀♀(18×)；F.腹面觀♀(55×)；G.氣門扳♀(129×)；H.跗節(jié)Ⅳ♀(60×)A.Dorsal view♂(15×);B.Ventral view♂(15×);C.Peritreme♂(90×);D.Tarsus Ⅳ♂(70×);E.Dorsal view♀(18×);F.Ventral view♀(55×);G.Peritreme♀(129×);H.Tarsus Ⅳ♀(60×)圖1 血紅扇頭蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.1 Morphological identification of R.sanguineus

A.背面觀♂(16×)；B.腹面觀♂(16×)；C.假頭基背面♂(85×)；D.氣門扳♂(95×)；E.背面觀♀(15×)；F.腹面觀♀(15×)；G.假頭基背面♀(70×)；H.氣門扳♀(100×)A.Dorsal view♂(16×);B.Ventral view♂(16×);C.Capitulum dorsal♂(85×);D.Peritreme♂(95×);E.Dorsal view♀(16×);F.Ventral view♀(16×);G.Capitulum dorsal♀(70×);H.Peritreme♀(100×)圖2 圖蘭扇頭蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 Morphological identification of R.turanicus

2.2 分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用PCR方法擴(kuò)增蜱蟲(chóng)線粒體16S rDNA特異性基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在460 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與目標(biāo)條帶大小相符(圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.檢測(cè)樣本；“-”陰性

2.2.2 遺傳進(jìn)化分析 將所得PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，結(jié)果表明，所采集的蜱蟲(chóng)分別為血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱。用MEGA7軟件對(duì)經(jīng)Blast比對(duì)得到的數(shù)據(jù)庫(kù)中的血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)采集的4條血紅扇頭蜱16S rDNA序列獨(dú)立的形成一個(gè)分支；本地采集的圖蘭扇頭蜱與已知的新疆的圖蘭扇頭蜱在一個(gè)分支上，具有很高的同源性(圖4)。

圖4 基于16S rDNA基因的蜱系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of ticks based on 16S rDNA genes

3 討論

本試驗(yàn)于2020年3至6月對(duì)烏魯木齊市共1 054只犬感染蜱蟲(chóng)的情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在240只犬的體表有蜱蟲(chóng)寄生。共采集到889只蜱。在蜱蟲(chóng)樣本收集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，從3月底開(kāi)始少部分犬體表出現(xiàn)少量蜱蟲(chóng)，4月中旬大量暴發(fā)一直持續(xù)至6月初開(kāi)始慢慢減少，6月中旬大量減少，6月底極少。這與已發(fā)表的文獻(xiàn)[15,18]新疆地區(qū)采集蜱蟲(chóng)時(shí)間及活動(dòng)高峰相似。

形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，鑒定要點(diǎn)為血紅扇頭蜱跗節(jié)Ⅱ～Ⅳ腹緣末端和亞末端均有小齒，肛側(cè)板后緣呈圓弧形較寬無(wú)齒突;圖蘭扇頭蜱有一顏色稍淺于盾板的尾突，肛側(cè)板內(nèi)緣淺凹處有一明顯齒突，部分血紅扇頭蜱與圖蘭扇頭蜱形態(tài)相似。所以對(duì)蜱種準(zhǔn)確的鑒定不能單純依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，應(yīng)該結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)同種蜱類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究。本試驗(yàn)在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合蜱類線粒體16S rDNA對(duì)蜱進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明新疆烏魯木齊市犬體表主要寄生的蜱蟲(chóng)種類主要為血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱，遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)新疆烏魯木齊市的血紅扇頭蜱與中國(guó)境內(nèi)河北地區(qū)的血紅扇頭蜱具有較高的同源性，序列P115與P112、P23、P104處于不同的遺傳進(jìn)化分支；圖蘭扇頭蜱與中國(guó)境內(nèi)河北地區(qū)與新疆的圖蘭扇頭蜱均有較高的同源性，P118與P7、P114、P116處于不同的遺傳進(jìn)化分支，均與國(guó)外報(bào)道的蜱蟲(chóng)16S rDNA基因有較大的差異，說(shuō)明血紅扇頭蜱和圖蘭扇頭蜱均具有遺傳進(jìn)化的保守性。此次發(fā)現(xiàn)的烏魯木齊市犬體表寄生的血紅扇頭蜱及圖蘭扇頭蜱優(yōu)勢(shì)度相當(dāng)，由于蜱傳播病原體一般與蜱種之間存在著一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，親緣關(guān)系越近的蜱種，其傳播相同病原體的機(jī)會(huì)越大，已知血紅扇頭蜱為犬巴貝斯蟲(chóng)的傳播媒介[14]，此發(fā)現(xiàn)有待于今后對(duì)烏魯木齊及周邊地區(qū)犬蜱、蜱傳犬巴貝斯蟲(chóng)病及蜱傳人畜共患疾病進(jìn)一步深入研究。