中藥復(fù)方對(duì)豬源多重耐藥大腸埃希氏菌的耐藥性消除研究

李志君，魯孟佳，張 雯，崔生玲，卿素珠，范云鵬，麻武仁，劉迎秋，楊 奇*，張為民*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川 750004)

近年來(lái)，研究證實(shí)中藥有助于減少抗菌藥物的使用并可以顯著地降低病原菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性。中藥主要從抑制滅活酶活性、消減耐藥基因的表達(dá)量、抑制外排泵、影響生物被膜的形成和改變細(xì)胞膜通透性等方面發(fā)揮消除細(xì)菌耐藥性的作用[1]。例如，穿心蓮提取物可下調(diào)Ampc基因的表達(dá)，從而有效降低細(xì)菌生長(zhǎng)速度[2]；木糖醇可通過(guò)破壞生物被膜的形成來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[3]；五味子提取物通過(guò)損傷菌體的完整性達(dá)到抑制菌株生長(zhǎng)的作用[4]。除此之外，許多藥用植物的次生產(chǎn)物也可以作為治療多重耐藥細(xì)菌感染的有效方法[5]。

中藥在臨床治療中主要以復(fù)方形式使用，以充分發(fā)揮藥物的藥理作用。因此，本研究依據(jù)中藥相須配伍原則，選擇楊樹(shù)花、地榆、地錦草、馬齒莧等4種清熱類中藥配伍，以1株豬源多重耐藥大腸埃希氏菌為研究對(duì)象，研究了4個(gè)中藥復(fù)方對(duì)豬源多重耐藥大腸埃希氏菌的體外抑制與耐藥性消除效果，為中藥復(fù)方用于臨床治療仔豬腹瀉奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與藥品 DNA Marker 2 000 bp,北京索萊寶科技有限公司;藥敏紙片,杭州濱和微生物試劑有限公司;2×EsTaqMaserMix(Dye),康為世紀(jì)生物科技有限公司;AG RNAex Pro Reagent和反轉(zhuǎn)錄試劑盒,湖南艾科瑞生物工程有限公司;瓊脂糖，廣州賽國(guó)生物科技有限公司;楊樹(shù)花、地錦草和馬齒莧均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)校園及周邊田間，并經(jīng)薄層色譜鑒定，地榆,楊凌華仁堂大藥房。

1.1.2 主要儀器 Nova Nano SEM-45場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡與TECNAI G2 SPIRIT BIO透射電子顯微鏡，美國(guó)FEI公司；熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司；TC-XP-G基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；水平電泳儀，美國(guó)Bio-Red公司。

1.1.3 菌株來(lái)源 大腸埃希氏菌來(lái)源于仔豬腹瀉病例，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供，已鑒定為多重耐藥大腸埃希氏菌(對(duì)氨芐西林、頭孢他啶、慶大霉素、大觀霉素、卡那霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、復(fù)方新諾明等抗菌藥物耐藥)；大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 中藥復(fù)方的制備 將楊樹(shù)花、馬齒莧、地錦草、地榆各中藥按1∶1的質(zhì)量比例組合成楊樹(shù)花-地榆、楊樹(shù)花-馬齒莧、楊樹(shù)花-地錦草、馬齒莧-地榆四種中藥復(fù)方，煎煮濃縮，使藥物終濃度為1 g/mL，置于4℃保存。

1.2.2 中藥復(fù)方對(duì)試驗(yàn)菌株最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6]，采用微量2倍稀釋法測(cè)定各中藥復(fù)方對(duì)分離的試驗(yàn)菌株的MIC。在96孔板上，用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯將各中藥2倍稀釋成不同濃度，使得1～10號(hào)孔藥物濃度分別為500、250、125、62.50、31.25、15.62、7.81、3.90、1.95、0.98 mg/mL，菌液稀釋后每孔接100 μL，每組中藥重復(fù)3次。37℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h。肉眼觀察澄清無(wú)細(xì)菌沉淀的孔對(duì)應(yīng)的最小濃度為中藥對(duì)大腸埃希氏菌的MIC。

1.2.3 中藥復(fù)方對(duì)菌株微觀形態(tài)的影響 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的試驗(yàn)菌株分別接種于1/2 MIC的含藥培養(yǎng)基和不含藥培養(yǎng)基，以不加藥的菌液為空白對(duì)照。置于37℃培養(yǎng)24 h后，收集菌體，按照掃描電鏡和透射電鏡制樣要求處理菌體，觀察各中藥復(fù)方作用后試驗(yàn)菌株微觀形態(tài)的變化。

1.2.4 中藥復(fù)方對(duì)菌株耐藥表型的影響 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的試驗(yàn)菌株接種至含有1/2 MIC藥物濃度的肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h，此為第1代，取第1代菌液100 μL轉(zhuǎn)接至相同藥物濃度的肉湯中，連續(xù)培養(yǎng)3代。

將第3代菌液均勻涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，選取菌落數(shù)50～300的培養(yǎng)基，采用影印法將菌落影印在含慶大霉素的培養(yǎng)基和不含抗菌藥物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在含抗菌藥物培養(yǎng)基不生長(zhǎng)而在不含抗菌藥物培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落為耐藥消除菌落。根據(jù)耐藥消除菌落數(shù)與檢測(cè)的總菌落數(shù)之比計(jì)算對(duì)應(yīng)中藥組方的消除率，并設(shè)置陰性對(duì)照組。

1.2.5 楊樹(shù)花-馬齒莧對(duì)菌株耐藥基因相對(duì)表達(dá)量的影響 采用水煮法提取用藥前后試驗(yàn)菌株的DNA，PCR擴(kuò)增ESBLs基因(blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaOXA)，AMEs基因(aac(3)-Ⅱ、aacC2、aph(3′)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ)和16S rRNA甲基化酶基因(rmtB、armA)，引物序列和反應(yīng)條件見(jiàn)參照文獻(xiàn)[7-9]。

Trizol法提取楊樹(shù)花-馬齒莧作用前后試驗(yàn)菌株的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA，以cDNA鏈為模板、16S為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。選取aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、aacC2這3種耐藥基因作為目的擴(kuò)增基因，用于擴(kuò)增目的基因的引物序列見(jiàn)表1。試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值，基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法來(lái)表示。

表1 多重耐藥大腸埃希氏菌耐藥基因引物序列Table 1 Primer sequences of drug-resistant genes in multidrug-resistant E.coli

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC測(cè)定

楊樹(shù)花-地榆和楊樹(shù)花-地錦草組方抑制效果較好，MIC均為62.50 mg/mL，楊樹(shù)花-馬齒莧組方抑菌效果最弱，MIC為250 mg/mL(表2)。

表2 各中藥復(fù)方對(duì)多重耐藥大腸埃希氏菌的MIC測(cè)定Table 2 MICs of herbal formulas on multidrug-resistant E.coli (mg/mL)

2.2 中藥復(fù)方作用后試驗(yàn)菌株的微觀形態(tài)變化

對(duì)照組的菌株呈直桿狀，兩端鈍圓，表面光滑，而經(jīng)中藥處理后的各組菌株均呈現(xiàn)了一定程度的形態(tài)改變。楊樹(shù)花-地榆作用后的菌株菌體脹大，表面粗糙并出現(xiàn)破損，個(gè)別菌體裂解、可見(jiàn)菌體碎片；楊樹(shù)花-馬齒莧、楊樹(shù)花-地錦草作用后的菌株菌體脹大，表面粗糙，發(fā)生凹陷，未見(jiàn)破損；地榆-馬齒莧作用后的菌株僅見(jiàn)菌體脹大，表面粗糙(圖1)。各組試驗(yàn)菌株的透射電鏡觀察見(jiàn)圖2。對(duì)照組菌株菌體結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)均勻。經(jīng)4個(gè)中藥復(fù)方作用后的菌株均表現(xiàn)為菌體變形，內(nèi)部空泡化，細(xì)胞膜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)不均勻，除楊樹(shù)花-地錦草組外，其余3組均發(fā)現(xiàn)有部分菌體破裂，內(nèi)容物溢出。

A.對(duì)照組；B～E.楊樹(shù)花-地榆,楊樹(shù)花-馬齒莧,楊樹(shù)花-地錦草,地榆-馬齒莧處理組(箭頭示腫大、凹陷；三角形示破損、碎片)A.Control group；B-E.Flos populi-Sanguisorbae Radix，F(xiàn)los populi-Portulaca oleracea，F(xiàn)los populi-Euphorbia humifuse，Sanguisorbae Radix-Portulaca oleracea(Arrows show swelling and depression；Triangles indicate damage and debris)圖1 各組多重耐藥大腸埃希氏菌微觀形態(tài)掃描電鏡圖(60 000×)Fig.1 Scanning electron microscope image of multidrug-resistant E.coli(60 000×)

A.對(duì)照組；B～E.楊樹(shù)花-地榆,楊樹(shù)花-馬齒莧,楊樹(shù)花-地錦草,地榆-馬齒莧處理組(箭頭示腫大、凹陷；三角形示破損、碎片)A.Control group；B-E.Flos populi-Sanguisorbae Radix，F(xiàn)los populi-Portulaca oleracea，F(xiàn)los populi-Euphorbia humifuse，Sanguisorbae Radix-Portulaca oleracea(Arrows show swelling and depression；Triangles indicate damage and debris)圖2 各組多重耐藥大腸埃希氏菌微觀形態(tài)透射電鏡圖(13 000×)Fig.2 Transmission electron microscope image of multidrug-resistant E.coli(13 000×)

2.3 中藥復(fù)方作用后試驗(yàn)菌株的耐藥表型變化

4個(gè)中藥復(fù)方對(duì)試驗(yàn)菌株的耐藥性均有消除作用，消除率均在10.00%以上(表3)，其中以楊樹(shù)花-馬齒莧組方的效果最好，消除率為16.00%。

表3 中藥復(fù)方對(duì)多重耐藥大腸埃希氏菌的耐藥性消除結(jié)果Table 3 Elimination of drug resistance of four Chinese herbal compounds to multidrug-resistant E.coli

2.4 試驗(yàn)菌株的耐藥基因檢測(cè)

PCR檢測(cè)多重耐藥大腸埃希氏菌10種耐藥基因中共檢出4種，分別為aph(3′)-Ⅱ、aac(3)-Ⅱ、blaOXA、aacC2(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.aph(3′)-Ⅱ；2.aac(3)-Ⅱ；3.blaOXA；4.aacC2；-.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000；1.aph(3′)-Ⅱ；2.aac(3)-Ⅱ；3.blaOXA；4.aacC2；-.Negative control圖3 大腸埃希氏菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Drug resistance gene test results of E.coli

2.5 楊樹(shù)花-馬齒莧作用后試驗(yàn)菌株的耐藥基因相對(duì)表達(dá)量變化

楊樹(shù)花-馬齒莧作用后，PCR檢測(cè)試驗(yàn)菌株AMEs 和ESBLs基因，結(jié)果顯示aacC3-Ⅱ、aacC2、aph(3′)-Ⅱ3種耐藥基因均出現(xiàn)丟失現(xiàn)象，而blaOXA基因無(wú)顯著變化。RT-PCR檢測(cè)楊樹(shù)花-馬齒莧作用后耐藥基因的相對(duì)表達(dá)量變化(圖4)。結(jié)果顯示，楊樹(shù)花-馬齒莧可以極顯著降低多重耐藥大腸埃希氏菌耐藥基因的表達(dá)水平(P<0.01)，aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、aacC2耐藥基因相對(duì)表達(dá)量分別下調(diào)了40%、89%和92%，表明中藥復(fù)方可能通過(guò)抑制耐藥基因的表達(dá)來(lái)消除細(xì)菌耐藥性。

圖4 楊樹(shù)花-馬齒莧作用后多重耐藥大腸埃希氏菌的耐藥基因相對(duì)表達(dá)量變化(**P<0.01)Fig.4 Changes of relative expression of drug-resistant genes in multi-drug resistant E.coli treated with Flos populi-Portulaca oleracea(**P<0.01)

3 討論

中藥復(fù)方作用后菌體脹大，表面凹陷、破損，內(nèi)部空泡化，細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模糊等，表明中藥可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性以達(dá)到抑菌目的，與文獻(xiàn)[10]的研究結(jié)果相似。大腸埃希氏菌經(jīng)榆梔散復(fù)方作用后AKP活性增加[11]，而AKP是一種位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的細(xì)胞內(nèi)酶，只有細(xì)胞壁被損壞，AKP漏出到細(xì)胞外環(huán)境，才能檢測(cè)到其活性[12-13]，可見(jiàn)中藥復(fù)方可以通過(guò)影響細(xì)菌正常結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)揮抗菌作用。

中藥濃度和培養(yǎng)時(shí)間的選擇很大程度上影響其消除效果，用1/2 MIC的雙黃連對(duì)耐藥大腸埃希氏菌進(jìn)行3次傳代培養(yǎng)，能有效消除多種抗菌藥物耐藥性[14]。五倍子水提物可通過(guò)抑制16S rRNA甲基化酶的活性，從而降低菌株的耐藥性，且1/2MIC比1/4MIC五倍子水提物對(duì)耐藥基因的作用更明顯[15]；厚樸酚也可通過(guò)抑制金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性來(lái)恢復(fù)耐藥大腸埃希氏菌對(duì)美羅培南的敏感性[16]。本研究采用影印法篩選細(xì)菌耐藥消除子，更能準(zhǔn)確地評(píng)估中藥對(duì)細(xì)菌的耐藥性消除效果，楊樹(shù)花-馬齒莧復(fù)方對(duì)多重耐藥大腸埃希氏菌的耐藥消除效果最好，消除率為16.00%。

本研究從4個(gè)中藥復(fù)方中選擇了耐藥消除效果最好的楊樹(shù)花-馬齒莧復(fù)方檢測(cè)大腸埃希氏菌攜帶的耐藥基因相對(duì)表達(dá)水平，熒光定量PCR結(jié)果表明，楊樹(shù)花-馬齒莧復(fù)方可以極顯著地降低豬源多重耐藥大腸埃希氏菌aac(3)-Ⅱ、aacC2和aph(3′)-Ⅱ耐藥基因的相對(duì)表達(dá)量，從而發(fā)揮降低菌株耐藥性的作用，表明中藥可通過(guò)下調(diào)主效耐藥基因的表達(dá)量來(lái)消除多重耐藥大腸埃希氏菌耐藥性。