新疆南疆部分地方品種羊無(wú)漿體的分子檢測(cè)與鑒定

金紫薇，羅慧麗，石文玉，辛園園，郎 平，薛芙蓉，陶大勇，趙愛(ài)云，齊 萌

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

無(wú)漿體(Anaplasma)是常見(jiàn)的蜱傳染病原體之一，可引起人和多種動(dòng)物消瘦、貧血、黃疸和膽囊腫大等臨床癥狀，嚴(yán)重感染時(shí)可導(dǎo)致死亡，造成較大的危害[1]。在世界范圍內(nèi)，綿羊普遍感染無(wú)漿體，以歐洲、美洲和非洲地區(qū)更為常見(jiàn)，在突尼斯的調(diào)查顯示，綿羊的無(wú)漿體感染率高達(dá)95.0%[2]；我國(guó)中部、南部和西北地區(qū)的羊只也常感染無(wú)漿體，我國(guó)中南部地區(qū)羊的無(wú)漿體感染率為73.9%[3]；伊犁地區(qū)牛、羊無(wú)漿體感染率均在50%以上[4]。我國(guó)已報(bào)道羊可感染的無(wú)漿體種類主要有綿羊無(wú)漿體(A.ovis)、牛無(wú)漿體(A.bovis)、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體(A.phagocytophilum)和山羊無(wú)漿體(A.capra)[5]，其中，A.phagocytophilum可感染人，存在自然疫源性風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在的威脅[6]。

我國(guó)新疆南疆地方品種綿羊經(jīng)長(zhǎng)期馴化和特殊生活環(huán)境選育，形成區(qū)域性分布特征，具有抗病力強(qiáng)、適應(yīng)荒漠環(huán)境、早熟和肉質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)良特性。然而，我國(guó)新疆南疆氣候獨(dú)特，蜱及蜱傳染病廣泛流行，綿羊易感染無(wú)漿體，策勒縣綿羊無(wú)漿體感染率為99.2%[7]；阿克蘇地區(qū)羊無(wú)漿體感染率為41.8%[8]，給養(yǎng)羊業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。本研究采用PCR法對(duì)新疆南疆5種地方品種綿羊的無(wú)漿體進(jìn)行檢測(cè)，調(diào)查其感染情況，以期為該地區(qū)綿羊無(wú)漿體病的防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2019年7月至8月，用5 mL EDTA采血管經(jīng)頸靜脈分別采集策勒黑羊(25只)、和田羊(25只)、巴爾楚克羊(10只)、卡拉庫(kù)爾羊(20只)和多浪羊(20只)血液樣本，共100份，依次編號(hào)；圈養(yǎng)和散養(yǎng)的綿羊各50只；冷藏箱保存送至實(shí)驗(yàn)室4℃保存，2周內(nèi)提取血液基因組DNA。

1.1.2 主要試劑與儀器 血液基因組DNA提取試劑盒，上海萊楓生物科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)與DNA Marker DL 2 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Sorvall Legend Micro 17型微量離心機(jī)，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；MC proS型梯度PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和JY系列電泳槽，北京市六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血液DNA提取 每份血液樣本取200 μL，按照血液基因組DNA提取試劑盒中的說(shuō)明書(shū)操作步驟提取血液DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)A.ovis的MSP4基因、A.phagocytophilum和A.bovis的SSU rRNA基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)種特異性引物，對(duì)所有提取的綿羊血液DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。A.ovis的MSP4基因第1輪PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；第2輪擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。A.phagocytophilum和A.bovis的SSU rRNA基因第1輪PCR擴(kuò)增條件均為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；第2輪擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)羊的A.capra的gltA基因位點(diǎn)通用引物，對(duì)所有提取的綿羊血液DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。A.capra的gltA基因第1輪PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；第2輪擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成，引物序列和目的片段見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增為25 μL反應(yīng)體系：模板DNA1 μL，2× EasyTaqPCR SuperMix (+dye)12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL，雙蒸水10.9 μL。每輪PCR擴(kuò)增均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性DNA樣本)和陰性對(duì)照(雙蒸水)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物通過(guò)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照保存。

表1 引物序列和目的片段Table 1 Primer sequences and fragment length

1.2.3 序列比對(duì)分析 PCR產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，所獲序列在NCBI中進(jìn)行Blast，下載同源序列，采用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)系列分析鑒定無(wú)漿體的種類。

2 結(jié)果

2.1 血液樣本DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別用A.ovis、A.phagocytophilum、A.bovis和A.capra種特異性引物對(duì)100份血液樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出65份A.ovis(圖1)和14份A.phagocytophilum目的條帶(圖2)，與陽(yáng)性樣本目的條帶相一致；未擴(kuò)增出A.bovis和A.capra目的條帶。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～8.樣本；N.陰性對(duì)照；P.陽(yáng)性對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Samples;N.Negative control;P.Positive control圖1 部分綿羊血液DNA樣本基于綿羊無(wú)漿體MSP4基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of the MSP4 gene of A.ovis in some blood DNA samples of sheep

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～8.樣本；N.陰性對(duì)照；P.陽(yáng)性對(duì)照M.DNA marker DL 2 000;1-8.Samples;N.Negative control;P.Positive control圖2 部分綿羊血液DNA樣本基于嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體SSU rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR result of the SSU rRNA gene of A.phagocytophilum in some blood DNA samples of sheep

2.2 南疆部分地方品種羊的無(wú)漿體感染情況

對(duì)100份地區(qū)品種羊血液DNA樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，有67份呈無(wú)漿體陽(yáng)性，總感染率為67.0%(67/100)，其中A.ovis感染率為65.0%(65/100)，A.phagocytophilum感染率為14.0%(14/100)，A.ovis和A.phagocytophilum混合感染率為12.0%(12/100)。5種地方品種羊均發(fā)現(xiàn)有無(wú)漿體感染，以多浪羊感染率最高，為100.0% (20/20)，和田羊感染率最低，為44.0%(11/25)；5種地方品種羊均發(fā)現(xiàn)有A.ovis感染，以多浪羊感染率最高，為100%(20/20)，巴爾楚克羊感染率最低，為30.0%(3/10)；5種地方品種羊均發(fā)現(xiàn)有A.phagocytophilum感染，以多浪羊感染率最高，為25.0%(5/20)，策勒黑羊感染率最低，為4.0%(1/25)(表2)。

表2 新疆南疆不同地方品種羊的無(wú)漿體感染情況Table 2 Prevalence of Anaplasma spp.in some local breeds of sheep in Southern Xinjiang

2.3 不同養(yǎng)殖條件地方品種羊的無(wú)漿體感染情況

對(duì)50份圈養(yǎng)地方品種羊的血液DNA樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，有30份呈無(wú)漿體陽(yáng)性，感染率為60.0%(30/50)，其中A.ovis和A.phagocytophilum感染率分別為60.0%(30/50)和4.0% (2/50)，混合感染率為4.0%(2/50)；對(duì)50份散養(yǎng)地方品種羊的血液DNA樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，有37份呈無(wú)漿體陽(yáng)性，感染率為74.0%(37/50)，其中A.ovis和A.phagocytophilum感染率分別為70.0%(35/50)和24.0%(12/50)，混合感染率為20.0%(10/50)(表3)。

表3 不同養(yǎng)殖模式條件下地方品種羊的無(wú)漿體感染情況Table 3 Prevalence of Anaplasma spp.in local breeds of sheep in different feeding patterns

2.4 種類鑒定和序列分析

65份A.ovis的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均成功雙向測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)分析，均鑒定為A.ovis，存在3個(gè)基因型，分別命名為基因型AO1(n=40)、基因型AO2(n=12)和基因型AO3(n=13)。基因型AO1(n=40)與我國(guó)新疆綿羊源A.ovis(KJ782401)的序列同源性為100.0%；基因型AO2(n=12)與突尼斯綿羊源A.ovis(KM285221)的序列同源性為100.0%；基因型AO3(n=13)與我國(guó)新疆綿羊源A.ovis(KJ782404)的序列同源性為100.0%。

14份A.phagocytophilum的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均成功雙向測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)分析，均鑒定為A.phagocytophilum，存在3個(gè)基因型，分別命名為基因型AP1(n=12)、基因型AP2(n=1)和基因型AP3(n=1)。基因型AP1和基因型AP2的序列分別與我國(guó)新疆綿羊源A.phagocytophilum(KJ782381)和(KJ782386)的序列同源性為100.0%；基因型AP3的序列與新疆綿羊源A.phagocytophilum(KJ782381)有2個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，在312堿基位置核苷酸G→A，在443堿基位置核苷酸T→C。

3 討論

無(wú)漿體病是多種無(wú)漿體引起的自然疫源性疾病之一，在我國(guó)尤其是牧區(qū)流行更為嚴(yán)重，其中對(duì)羊危害較大的是A.ovis和A.phagocytophilum，常可引起患羊增重減緩、產(chǎn)奶量下降及流產(chǎn)，但急性發(fā)病時(shí)亦可導(dǎo)致死亡，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[3,5,9]。用PCR法檢測(cè)我國(guó)6個(gè)省份綿羊和山羊的無(wú)漿體，發(fā)現(xiàn)感染率為36.2%(205/567)和58.2%(105/251)[11]；甘肅省羊的無(wú)漿體感染率為30.6%(76/219)[12]；安徽省羊的無(wú)漿體感染率為33.0%(67/203)[13]；策勒縣綿羊的無(wú)漿體感染率為99.2% (119/120)[7]。本次發(fā)現(xiàn)新疆南疆5種地方品種羊的無(wú)漿體總感染率為67.0%(67/100)，與上述調(diào)查結(jié)果相一致，不同地區(qū)羊的無(wú)漿體感染率存在一定差異，可能與地理區(qū)域和病媒蜱的分布特點(diǎn)有一定關(guān)聯(lián)。

在新疆西部和南部地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn),羊的A.ovis和A.phagocytophilum感染率分別為40.5%(51/125)和28.8%(36/125)[14]；阿克蘇地區(qū)羊的A.ovis和A.phagocytophilum的感染分別為33.16%(320/965)和29.43%(284/965)[8]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，A.ovis感染率65.0%(65/100)高于A.phagocytophilum感染率14.0%(14/100)，與上述報(bào)道相一致。近年來(lái)，A.phagocytophilum在湖南、山西和新疆等地區(qū)人的血液樣本中檢測(cè)到，提示其具有人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)人獸共患無(wú)漿體病的檢測(cè)與防控，保障人畜健康[15-16]。

河南省放牧湖羊無(wú)漿體感染率為68.4%(26/38)，明顯高于舍飼湖羊感染率22.1%(28/127)[17]。從我國(guó)12個(gè)縣區(qū)采集300份奶山羊血液樣品進(jìn)行無(wú)漿體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)放牧奶山羊感染率為48.2%(67/139)[9]，明顯高于舍飼奶山羊感染率1.2%(2/161)。本次調(diào)查結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致，散養(yǎng)羊無(wú)漿體感染率74.0%(37/50)高于圈養(yǎng)羊的感染率60.0%(30/50)，提示圈養(yǎng)羊可能因其養(yǎng)殖方式及定期驅(qū)蟲(chóng)減少了與病媒蜱接觸的機(jī)會(huì)；而散養(yǎng)羊在放牧過(guò)程中更易與蜱接觸，被蜱叮咬幾率增加導(dǎo)致無(wú)漿體感染率上升。本次調(diào)查顯示，南疆不同地方品種綿羊的無(wú)漿體感染情況存在差異，放牧條件下較舍飼條件下更易感染無(wú)漿體，養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)羊體表寄生蜱的檢查與防治。